實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系-資料下載頁(yè)
2025-07-18 22:09本頁(yè)面
【正文】 （異丙醇和膠之間有一條折射線），再等 5min使膠充分凝固，倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按下表配 4％的濃縮膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 三、 操作步驟 分離膠 (10%) 濃縮膠 (4%) 超純水 ml 3 ml 30% Acr/Bis 2 ml Buffer 10% SDS 100 181。l 50 181。l 1%明膠 0 10% Ap 100 181。l 25 181。l TEMED 8 181。l 5 181。l 3. 在每個(gè)加樣孔中加入 20 181。l樣品 。 4. 電泳： 在 4℃ 100V下，約 3h。 5. 凝膠的處理： a) 電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動(dòng)下洗滌 1h，其間換液一次； b) 棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒(méi)過(guò)膠面，至 37℃ 恒溫箱中， 24h后取出； c) 棄去孵育緩沖液，加入 %考馬斯亮藍(lán)染液染色約30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍(lán)色背景和白色條帶均十分明顯時(shí)，用 5％乙酸中止脫色； d) 待凝膠在 5％乙酸中恢復(fù)到適當(dāng)大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值相對(duì)定量樣品中酶活性。 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 N N P P 135kD 92kD 72kD NGAL/MMP9 ProMMP2 MMP9 1. 制備聚丙烯酰胺時(shí)應(yīng)注意排除氣泡 。 2. 明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和 PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。 3. 制膠時(shí)， 用厚度大的梳子做上樣孔 4. 孵育的 37 ℃ 不要在 CO2培養(yǎng)箱中，因?yàn)闀?huì)改變孵育液的 pH值，在普通孵箱即可。 5. 明膠要 4℃ 保存，配好后 1周內(nèi)使用 。 6. 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，因此稱量時(shí)要戴手套。 注意事項(xiàng) ?我們知道，核酸中的密碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，而核酸的合成又需要多種酶來(lái)完成。兩者互為生成的基礎(chǔ)，但重要性各不相同。試推測(cè)：先有蛋白質(zhì)還是先有核酸？說(shuō)明理由。 ?蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法有哪些？分析其優(yōu)缺點(diǎn)。 ?可自選討論題目，你感興趣的題目是： 課堂分組討論
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