[基礎醫(yī)學]功能基因組研究-資料下載頁
2024-12-07 23:18本頁面
【正文】 “并重新“拼接” ,形成一個新的雜合 DNA分子 ,然后將它導入微生物或真核細胞內(nèi) ,使該分子得到無限繁殖 ,并可使該基因在細胞中表達 ,產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型。 基因克隆 一、 克隆概念 ：克隆（原指一個親本細胞產(chǎn)生成千上萬個相同細胞組成群體的過程 , clone），也就是細胞的無性繁殖。 二、分子克隆的關鍵技術： DNA重組技術。該技術是基因工程技術的核心?；静僮鞑襟E如圖 1所示 。 目的基因 克隆載體 連 接 DNA重組體形成 含重組子的克隆菌 表達產(chǎn)物 RE消化 RE消化 T4 DNA連接酶 轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）宿主細胞 誘導表達 獲得某一基因或 DNA片段，將其插入載體 DNA分子中，形成一個新的重組DNA分子。 將 DNA重組體導入受體細胞（宿主細胞），并在其中復制保存。 陽性重組體細胞的篩選和鑒定。 Tvector or Teasy vector Expression vector 外源基因經(jīng)酶切插入特定的表達載體 用通用引物測定基因核苷酸序列 在原核或真核細胞中表達 SDSPAGE 表達水平測定 純化產(chǎn)物 Western blot 免疫反應性鑒定 免疫原性鑒定 分子篩 反相層析 親和層析 功能性鑒定 活性鑒定 外源基因 PCR product 基因克隆 三、 基因克隆所需的生物材料 RNA（ mRNA） 、 DNA抽提試劑盒 cDNA合成試劑盒 工具酶： （ 1） 限制性內(nèi)切酶 （ restriction endonucleases， RE）是一類能識別和切割雙鏈 DNA分子內(nèi)特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶 ， 也是原核細胞所特有的酶 。 只有 II型內(nèi)切酶在分子生物學中應用 。 各型限制性核酸內(nèi)切酶特征 切割位點 甲基化作用 限制作用是否需要 ATP I 型 非特定在識別序列前后 1001000 bP范圍內(nèi) 有 需要 II 型 特定 在識別序列中或近處 無 不需 III型 特定 在識別序列 3‘端 25 27bp處 有 需要 影響 限制性核酸內(nèi)切酶 酶解反應的因素 1. DNA純度 ,DNA純度高 ,酶解效率也高。 2. DNA分子的結構和構型 ,環(huán)狀超螺旋 DNA的酶解效率低 于線型 DNA,限制酶識別序列中核苷酸的甲基化將阻止限制酶的切割 。 3. 反應體系 ,包括緩沖糸統(tǒng)、 pH值、 Mg離子濃度、NaCl濃度等 . 4. 溫度和時間 ,一般為 370C。 在保證限制酶切割效率前提下 ,盡量避免長時間酶解反應 , 5. 酶及酶量 , 高質(zhì)量的酶及不使用過高的酶濃度 ,防止雜酶活性的產(chǎn)生。
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