[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]功能基因組研究-資料下載頁(yè)
2024-12-07 23:18本頁(yè)面
【正文】 “并重新“拼接” ,形成一個(gè)新的雜合 DNA分子 ,然后將它導(dǎo)入微生物或真核細(xì)胞內(nèi) ,使該分子得到無(wú)限繁殖 ,并可使該基因在細(xì)胞中表達(dá) ,產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型。 基因克隆 一、 克隆概念 ：克隆（原指一個(gè)親本細(xì)胞產(chǎn)生成千上萬(wàn)個(gè)相同細(xì)胞組成群體的過(guò)程 , clone），也就是細(xì)胞的無(wú)性繁殖。 二、分子克隆的關(guān)鍵技術(shù)： DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是基因工程技術(shù)的核心?；静僮鞑襟E如圖 1所示 。 目的基因 克隆載體 連 接 DNA重組體形成 含重組子的克隆菌 表達(dá)產(chǎn)物 RE消化 RE消化 T4 DNA連接酶 轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）宿主細(xì)胞 誘導(dǎo)表達(dá) 獲得某一基因或 DNA片段，將其插入載體 DNA分子中，形成一個(gè)新的重組DNA分子。 將 DNA重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞（宿主細(xì)胞），并在其中復(fù)制保存。 陽(yáng)性重組體細(xì)胞的篩選和鑒定。 Tvector or Teasy vector Expression vector 外源基因經(jīng)酶切插入特定的表達(dá)載體 用通用引物測(cè)定基因核苷酸序列 在原核或真核細(xì)胞中表達(dá) SDSPAGE 表達(dá)水平測(cè)定 純化產(chǎn)物 Western blot 免疫反應(yīng)性鑒定 免疫原性鑒定 分子篩 反相層析 親和層析 功能性鑒定 活性鑒定 外源基因 PCR product 基因克隆 三、 基因克隆所需的生物材料 RNA（ mRNA） 、 DNA抽提試劑盒 cDNA合成試劑盒 工具酶： （ 1） 限制性內(nèi)切酶 （ restriction endonucleases， RE）是一類能識(shí)別和切割雙鏈 DNA分子內(nèi)特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶 ， 也是原核細(xì)胞所特有的酶 。 只有 II型內(nèi)切酶在分子生物學(xué)中應(yīng)用 。 各型限制性核酸內(nèi)切酶特征 切割位點(diǎn) 甲基化作用 限制作用是否需要 ATP I 型 非特定在識(shí)別序列前后 1001000 bP范圍內(nèi) 有 需要 II 型 特定 在識(shí)別序列中或近處 無(wú) 不需 III型 特定 在識(shí)別序列 3‘端 25 27bp處 有 需要 影響 限制性核酸內(nèi)切酶 酶解反應(yīng)的因素 1. DNA純度 ,DNA純度高 ,酶解效率也高。 2. DNA分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型 ,環(huán)狀超螺旋 DNA的酶解效率低 于線型 DNA,限制酶識(shí)別序列中核苷酸的甲基化將阻止限制酶的切割 。 3. 反應(yīng)體系 ,包括緩沖糸統(tǒng)、 pH值、 Mg離子濃度、NaCl濃度等 . 4. 溫度和時(shí)間 ,一般為 370C。 在保證限制酶切割效率前提下 ,盡量避免長(zhǎng)時(shí)間酶解反應(yīng) , 5. 酶及酶量 , 高質(zhì)量的酶及不使用過(guò)高的酶濃度 ,防止雜酶活性的產(chǎn)生。
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