【正文】 A B A 組特有的條帶 B 組特有的條帶 A , B 共有但豐度不同的條帶D D R T － P C R?(四 )用免疫的方法分離克隆的目的基因 ? ? ，一擴大信號。 ? ； ? 。 噬菌體 , 粘粒 或質(zhì)粒文庫 影印到 NC 膜上 進行分子雜交或免疫反應 純化噬菌斑和菌落 母板 影 印 到 NC 上 目 的 蛋 白 抗 抗 體 目 的 蛋 白 抗 體 放 射 自 顯 影 的 X 光片 利 用 抗 體 篩 選 表 達 文 庫六 .篩選 YAC文庫 ? 從理論上只要分離到大量的基因組克隆，并構(gòu)建它們的限制圖就可鑒別出重疊的基因組克隆，進而構(gòu)建出全基因組的物理圖。 ? 實際上是很困難的。 ? (1)重疊的片段多，重疊的長度不均衡； (2)工作量大； ? 一個標準的 YAC文庫插入片段的總和相當于 5～ 8個基因組大小，則需約 500個 96孔板和相應數(shù)量的雜交膜。因此，一般采 Locus specfic PCR來篩選。用“ 集” (pool)為單位 (相當于 4塊 96孔板 )或用“ 超級集” (相當與 20塊 96孔板 )逐輪篩選，逐步縮小篩選范圍。 七 .基因定位克隆 ? 基因定位克隆 (mapbased cloning)是用于分離未知結(jié)構(gòu)的目的基因。 ? 從理論上說，任何已鑒別的突變基因都可用這種方法分離出來。 ? 條件是： (1)已建立含此基因的 YAC文庫； (2)要有與目的基因緊密連鎖的標記 (已知基因或分子標記 )。 (一 ).染色體體步移法 (chromosome walking) (1)方法： 在人類和其它動物的定位克隆可用 染色體體步移法： 用鄰近的標記為探針，在基因組文庫中篩選重疊克隆。直到目的基因被克隆出。 (2)步移的方向和進度可通過中期染色體原位分子雜交來確定。 (3)大范圍染色體步移有困難，因存在重復順序而不能進行分子雜交。 (4)此可通過染色體跳躍 (chromosome jumping) 來克服。 R F L P 克隆 目的基因 分離起始克隆 構(gòu)建起始克隆的限制圖 E H B B H 亞克隆 B － H 限制片段 用同位素標記 B － H 限制片段為探針，從文庫中篩選相鄰的重疊序列克隆 構(gòu)建相鄰克隆的限制圖 B H H E 亞克隆 H － E 限 制 片 段 用同位素標記 H － E 限制片段為探針 , 篩選相鄰的重疊序列克隆 多此重復前步驟，直至克隆出目的基因 目的基因克隆(二 )染色體跳躍和跳查文庫 跳查文庫 (jumping library) 這種文庫的特點是每一克隆中含有原先相距很遠的 2個 DNA片段。跳查文庫是分離基因或特定 DNA序列的有效篩查方法。 R B R R B B R R B B R E . c o R I ( R ) 部分酶切 分離長 100 ～ 2 0 0 k b 的 DNA 片段 R B R R B B R R 克隆到無 B a m HI 切點的粘粒中 粘粒 cos R R R B B 重組 + R B R R R R Bam HI 完全酶切 R R c o s R R R c o s 切開 c o s c o s 體外包裝 用 為探針 用 為探針 分離重組子 分離遠距離 序列 跳 查 文 庫 的 構(gòu) 建 (三 )連鎖文庫 (linking library) ? 為了使篩查朝一個方向進行下去，要建立 連鎖文庫 。使釣出的片段和上一個片段相鄰接。 跳查探針 連鎖探針 大分子的 DNA B B N B B B a m HI 部分酶切 切成長約 2 0 k b 的片段 克隆到含標記的 載 體 中 Not I B S u + B B S u + B B S u + B N o t I 切割 N S u + N 連接到載體上 N S u +