真核基因組dna提取-資料下載頁
2025-05-11 00:43本頁面
【正文】 形式保存某種生物的全部遺傳信息和分離克隆有用的目的基因； 染色體 DNA非常復(fù)雜，單個基因所占比例十分微小，若想從龐大的基因組中將其分離出來，一般需要先進行擴增，所以需要構(gòu)建基因組文庫。 基因組文庫構(gòu)建 構(gòu)建基因組文庫用載體 ?λ噬菌體置換型載體或黏粒載體 ?質(zhì)粒載體：小，只能用于構(gòu)建葉綠體基因組文庫。 基本程序 （ 1）基因的克隆 （ 2）克隆基因的分離 （ 3）分離基因的檢測與分析 分離到的基因用于 ： 基因治療（例如正常的人的腺苷脫氫酶 （ ADA）基因成功植入 ADA缺乏癥患者的淋巴結(jié)構(gòu) ）、 DNA疫苗（ HIV9P160核酸疫苗）、蛋白質(zhì)產(chǎn)品（胰島素、干擾素、生長因子等） 2. Southern blot ? 指將電泳分離的 待測 DNA片段 結(jié)合到一定的 固相支持物 上，然后與存在于液相中的標記 核酸探針進行 雜交 的過程，是目前最常用的核酸分子雜交方法。 ? 由于 Southern 印跡雜交的高靈敏度和高特異性，它廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測、 DNA指紋分析和 PCR產(chǎn)物判斷等研究中。 核酸雜交 : Southern blot：用于 DNA分析 Northern blot：用于 RNA分析 3. PCR ? PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)，可以從復(fù)雜的材料中擴增 特殊 DNA序列的強有力的技術(shù)。用采用特意引物的 PCR直接從基因組 DNA中分離基因。 ? 缺點：由于 PCR酶的持續(xù)合成能力的不足和校正能力的缺陷，僅對較短產(chǎn)物的擴增有效（＜ 5Kb）。 總 RNA的提取 提取 RNA實驗的關(guān)鍵 ___嚴格防止 RNase的污染 核糖核酸酶 (RNase): 催化降解 RNA為小分子片段的核酸酶 無處不在 體內(nèi)： 取材要新鮮或液氮保存； 破碎細胞要快，盡量在低溫下進行 體外： 空氣、試劑、耗材及實驗者本身 體外 RNAase的去除 ? ① 所用的各種器皿：將玻璃器皿、離心管、吸頭等浸泡于% DEPC溶液中 37℃ 下處理 12 h， 121℃ 高壓滅菌 30 min，再烘干。 ? ② 配溶液時所用的超純水需 DEPC處理 ，即 % DEPC溶液配制后 37℃ 放置 12 h， 121℃ 高壓滅菌 30 min；盡可能用未曾開封的試劑。 ? ③ 實驗者本身：戴一次性干凈手套、口罩，避免外界環(huán)境中 RNA酶降解 RNA。 ? ④儀器： 70%乙醇拭擦。 RNA提取原理 ? 商業(yè)化試劑盒（ RNAiso plus試劑、 TRIzol reagent）中含有 強變性劑（如異硫氰酸胍）， 能夠充分裂解細胞，溶解蛋白質(zhì)，使核蛋白與核酸分離。 ? 再加入 氯仿 離心后，溶液會形成 上清層、中間層和有機下層 （含有蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸、細胞碎片和少量 DNA）， RNA存在于上清層 中。 ? 小心收集上清層后，經(jīng) 異丙醇沉淀 即可回收得到總 RNA。 ? 高純度的 RNA，適用于 Northern blot分析、 mRNA純化、RTPCR和體外翻譯等分子生物學(xué)實驗。 注意 1. RNA濃度 : RNA (mg/mL) = OD260 稀釋倍數(shù) 40/1000。 2. RNA的純度： OD260 /OD280 的比值在 ~， 比值較 低 ，說明含有 蛋白質(zhì)污染 ； 比值太 高 ，提示 RNA有降解 。 3. RNA電泳 可能是兩種 rRNA (28s和 18s)，條帶亮度比例約 2:1。 條帶彌散，說明 RNA可能已降解。 若條帶大小大于 28s，則可能有基因組 DNA的污染，用DNase I處理 DNA污染較好。
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