【正文】 F4 家系 為 試驗 材料 ， 對水稻倒伏相關(guān)性狀機械強度與穗型相關(guān)性狀穗長、穗粒數(shù)、穗 著粒密度 、穗彎曲度 、 結(jié)實率 、 一次枝梗、二次枝梗 、有效穗數(shù) 等 性狀進行 QTL 定位及其與環(huán)境互作研究 ， QTL 表達的遺傳背景研究和不同性狀遺傳區(qū)段重疊研究 ， 旨在更好的了解復雜抗倒伏性狀的遺傳基礎(chǔ) ， 豐富抗倒伏 QTL 遺傳信息 ， 結(jié)合已 報道的抗倒伏 QTL 位點進行比較 ， 重點挖掘受遺傳背景影響較大、與環(huán)境互作效應較小的 QTL， 為抗倒伏 相關(guān)性狀和穗型相 關(guān) 性狀的 QTL 精細定位和分子標記輔助選擇育種 以及為 不同性狀遺傳重疊在高效抗倒伏育種中的應用 提供理論依據(jù) 。 寧夏大學碩士學位論文 第二章 材料與方法 10 第二章 材料與方法 供試材料 將 莖稈 機械強度大 、 直立 穗 型 、 穗 著粒密度 較 大 的 NG172 品系 與 莖稈 機械強度小 、 彎曲穗型 、 穗 著粒密度 較 小 的日本晴 品種 雜交 ， 獲 得 244 個 F2 分離 群體 ，再 利用 F2代單株衍生 獲得 FF4 代 家系 群體 。 2. 2 田間試驗 2021 年 5 月 20 日 ， 將兩個親本與 244 個 F2分離 群體 播種于中國農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所網(wǎng)室試驗池 內(nèi) ， 6 月 20 日單本移栽 ， 行株距為 30cm10cm。 2021 年 11 月 23 日 ， 將兩個親本與244 個 F3家 系播種于 海南 三亞 中國農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所試 驗基地 ， 12 月 20 日單本移栽 ，行株距為 30cm10cm。每個株系栽 12 穴 ， 2 行區(qū)， 重復一次 ，順序排列 。 2021 年 5 月 27 日 ， 將兩個親本與 244 個 F4家 系播種于中國農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所 昌平試驗基地 ， 6 月 25 日單本移栽 ， 行株距為 30cm10cm。每個 家 系栽 12 株 ， 2 行區(qū)，順序排列， 重復一次 。 每 m2施純氮 kg。病蟲害防治、田間除草和水分管理等遵循當?shù)氐臉藴史椒ā? 2. 3 項目測定及方法 莖 桿 機械強度 的測定 及方法 待植株齊穗期 30 天后， 將植株 距地面 40cm 以 上 都 剪掉 ， 在稻株距地面 20cm 高處 ， 采用 彈簧測力計 垂直于稻株莖稈向前 拉伸 ， 將稻莖 拉 彎至 45176。傾角處 (用 等腰直角三角形 測定 45176。)， 此時 ，彈簧測力計 記錄的 最大 壓力值 ， 即水稻單株 莖稈 機械強度 ， F2 群體每株 進行 多個 單莖 莖稈 機械強度 測量 ， 求 平 均值 作為每株單莖 機械強度 ； F3與 F4家系 群體每株在稻株距地面 20cm 高處 ， 用沒有彈性 的繩子 同 株 捆綁在一起 ， 將彈簧測力計掛鉤于繩子上 ， 進行測量， 每小區(qū)測 10 株 ， 求平 均值 ， 得到單株 莖稈 機械強度 。 （見圖 ） 圖 彈簧測力計測量單株莖稈機械強度的方法 The method measuring individual Stem mechanic strength by spring dynamometer 寧夏大學碩士學位論文 第二章 材料與方法 11 2. 穗型相關(guān)性狀的測定及方法 所有供試材料依據(jù) 齊穗期 30 天后 及時測量穗彎曲度 ， 將量角器 0176。與莖稈重合 ， 測量穗莖夾角。 F2 代， 每株 的 每穗 都 進行彎曲度測量 ， 取其平均 值； F3 與 F4 代 每小區(qū)測 10 株 ， 每株 選 取具有代表性的穗測量其彎曲度 ， 求 平 均值 。 F2 代調(diào)查性狀有： 穗長、穗粒數(shù)、 穗 著粒密度 、穗彎曲度 ； F3代調(diào)查性狀有： 穗長、穗粒數(shù)、 穗 著粒密度 、穗彎曲度 、結(jié)實率； F4 代調(diào)查性狀有： 穗長、有效穗數(shù)、 穗粒數(shù)、 穗 著粒密度 、穗彎曲度 、有效穗數(shù)、 一次枝梗、二次枝梗 。把 測量穗彎曲度的穗 作為樣本 取下裝進信封（編號與大田相同） ， 在室內(nèi) 考種穗部性狀。 穗著粒密度 =穗粒數(shù) /穗長 ； 結(jié)實率 =實粒數(shù) /(實粒數(shù) +秕粒數(shù) )100% 2. 4 DNA 提取及 PCR 擴增 的提取 在 F2 代按個體 進行葉片取樣 ， 每個單株取 2～ 3 片葉片裝入自封袋 ， 放置于 70℃ 超低溫冰箱備用。 DNA 的提取采用稍有改進的 CTAB 法 [45]。 操作 步驟 如下： （ 1） 將水稻葉片剪 成 1cm 長的小段 ， 用液氮磨成粉末或者用高通量組織研磨器將葉片震碎； （ 2） 加入 750uLCTAB 提取緩沖液 ， 振蕩使提取液與葉片粉末充分混勻 ， 入水浴 (65℃ )約 45分鐘 ， 期間 每 10 分鐘 振蕩 一 次； （ 3） 加入 氯仿 /異戊醇 (24:1)， 溫和搖動 ， 使成乳狀液； （ 4） 12021rpm 離心 10 分鐘 ， 取上清液置于 的離心管中 ； （ 5） 加入 1:1 體積于上清液 的 預冷 異丙醇 ， 混勻 (輕微 )， 冰浴半小時以上； （ 6） 12021rpm 離心 6 分鐘 ， 棄上清 ， 加入適量 70％酒精洗滌一次 ， 再倒掉洗滌酒精液 ， 將離心管 平放 在草紙上 ， 自然陰 干； （ 7） 加入 500uL ddH20， 等待其溶解后在渦旋儀上震蕩 5 秒鐘后待用。 PCR 擴增 PCR 擴增 體系為 10 181。L， 包含 10 PCR buffer (含 Mg2+) 181。L， mMol /L 的 dNTP 181。L，5 U /181。L 的 Taq 酶 181。L， 10 181。mol/ L 的 SSR 引物 各 181。L， 20 ng/ 181。L DNA 181。L， ddH2O 。 PCR 儀擴增程序為： 94℃ 預 變性 5min， 94℃ 變性 30 sec， 55℃ 復性 30 sec， 72℃ 延伸30 sec， 共進行 37 個循環(huán) ， 然后 72℃ 延伸 7 min， 保持于 4℃ 。 電泳 采用 6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測擴增結(jié)果。 實際操作方法如下： （ 1） 制膠用的玻璃板全部洗干凈 ， 晾干備用 。 （ 2） 將成膠玻璃板放在下層 ， 將帶有凹口的放在上層 ， 兩層玻璃板之間的兩側(cè)放入 間 隔片 ， 將寧夏大學碩士學位論文 第二章 材料與方法 12 玻璃板對齊 ， 放入封口槽 ， 并同定在制膠架上 ， 最后將兩側(cè)對齊后用 夾子夾緊 ， 將熔好的瓊脂糖倒進封口槽 ， 封口備用 。 （ 3） 在 50 mL 燒杯中依次加入適量的 5TBE 緩沖液 ， 40％的丙烯酰胺、 10％的過硫酸銨和TEMED， 迅速攪勻后 ， 立即灌入準備好的玻璃板中 ， 灌完膠后立刻插入梳子。這一過程要求不能產(chǎn)生氣泡。然后將膠 板 傾斜放置于桌面上 ， 等膠凝固備用。 （ 4） 等膠完全凝固后 ， 取下夾子 ， 去掉底部的瓊脂糖凝膠 ， 凹口朝內(nèi) ， 固定在電泳槽上 ， 放膠板 時膠的底部不能產(chǎn)生氣泡 ， 向電泳槽內(nèi)加入 1 TBE 緩沖液 ， 小心拔出梳子 ， 待點樣 。 （ 5） 在 PCR 擴增產(chǎn)物中加入適量的溴酚藍 ， 離心混勻后點樣 。 （ 6） 吸取 2uL 樣品點樣 ， 并以 120V 的恒壓進行電泳 ， 電泳結(jié)束后取出聚丙烯酰胺凝膠 ， 用水清洗 1 次后放入 %的硝酸銀溶液中 ， 放置于水平搖床上染色 1520 min。 （ 7） 倒掉硝酸銀溶液 ， 再用水沖洗 2 遍 ， 放入提前準備好的顯色液中 (含甲醛 2 mL 和氫氧化鈉500 mL)， 放置搖床上顯色 ， 直至能見清晰條帶 。 （ 8） 倒掉顯色液 ， 再用自來水沖洗多遍 ， 放置在凝膠顯色以上 ， 掃描成像 。 （ 9） 分析成像結(jié)果并保存。 2. 5 分子標記連鎖圖譜的構(gòu)建和 QTL 檢測 利用試驗室已合成的 1480 對 SSR 引物 ， 10 對 STS 引物和 10 對 Indel 引物， 進行親本間多態(tài)性檢測 ， 選取親本間有差異的引物作為候選引物 ， 參考 GRAMENE 網(wǎng)站上已公布的遺傳連鎖圖譜中各標記的相對位置 ， 進行多態(tài)標記的篩選和 F2 群體內(nèi)單株帶型的檢測 ， 所選引物盡可能的覆蓋水稻整個染色體組 ， 且分布較均勻。 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 F2分離群體，與 母本 NG172 相同 的帶型記為 “2”，與 父本日本晴 相同 的帶型記為 “0”，雜合個體記為 “1”， 缺失條帶記為“ 1”。用 軟件 構(gòu)建 雜交群體遺傳連鎖圖譜 ， 標記間的遺傳距離采用 Kosambi[83]函數(shù)進行估算 ， QTL 檢 測選用完備復合區(qū)間（ ICIM）分析方法 ， 以 LOD 值 作為 QTL 檢測的閾值 [84]。以 F2 單莖 機械強度 、穗長、穗粒數(shù)、穗密度、穗彎曲度作為輸入單元；以 F3 單株莖稈 機械強度 、穗長、穗粒數(shù)、穗 著粒 密度、穗彎曲度、結(jié)實率作為輸入單元；以 F4 單株莖稈 機械強度 、穗長、穗粒數(shù)、穗 著粒 密度、穗彎曲度、一次枝梗粒數(shù)、二次枝梗粒數(shù)、有效穗數(shù)作為輸入單元 ， QTL所解釋的表型變異率以及 LOD 峰值處的加性效應 ， 是由軟件采用的逐步回歸方法計算后獲得。一般把以 LOD 峰值處為中心的 20cM 作為所檢測出的 QTL 置信區(qū)間 [85]。 寧夏大學碩士學位論文 第三章 結(jié)果與分析 13 第 三章 結(jié)果分析 親本及 其 雜交后代 群體 莖稈 機械強度和穗型 相關(guān) 性狀的表 型變異 親本及其 F2代群體莖稈機械強度和 4 個穗型相關(guān)性狀的表 型變異 親本 NG172 和 日本 晴 及 其后代分離群體 F2 代 莖稈機械強度和 4 個 穗型 相關(guān)性狀的 表型 值見表 。 親本 NG172 的 穗彎曲度 與 穗長 的平均值小于親本 日本晴 相應性狀的平均值 ， 而 莖 稈機械強度 、 穗粒 數(shù) 和 穗著粒密度 的平均值 均 大于親本日本晴相應性狀的平均值 ， 5 個 性狀在群體內(nèi)均呈雙向超親分離 ， 且在群體內(nèi)呈連續(xù)分布。 穗彎曲度 的變異系數(shù)最大 ， 為 %， 穗長 的變異 系數(shù)最小 ， 為 %。 表 親本 NG172 和日本晴及其 F2 代分離 群體莖稈機械強度和 4 個穗型相關(guān)性狀的表型 變異 Table Performance of Culm mechanical strength and four paniclerelated traits in “ NG172/ Nipponbare” F2 and their parents 性狀 親本 Parents F2 群體 F2 popuLation Traits NG172 日本晴 Nipponbare 平均值 Mean 177。 SD 變幅 Range 峰度 Kurtosis 偏度 Skewness 變異系數(shù) CV(%) 莖稈機械強度 CMS 177。 ～ 穗彎曲度 PC 177。 ～ 穗粒數(shù) SPP 177。 ～ 穗長 PL 177。 ～ 穗著粒密度 PGD 177。 ～ CMS: Culm mechanical strength, PC: Panicle curvature, SPP: Spikelets per panicle, PL: Panicle length, PGD: Panicle grain density 親本及其 F3家系 植株 莖 稈機械強度和 5 個穗型相關(guān) 性狀的表 型變異 親本 NG172 和日本晴及 F2 群體單株衍生的 F3 家系莖 稈機械強度和 5 個 穗型 相關(guān)性狀的值見 表 ， 親本 NG172 的 穗彎曲度 與 穗長 的平均值小于親本日本晴相應性狀的平均值 ， 而 莖稈機械強度 、 穗粒數(shù) 、 穗著粒密度 和 結(jié)實率 的平均值均大于親本日本晴相應性狀的平均值 ， 6 個性狀在群體內(nèi)均呈雙向超親分離 ， 且在群體內(nèi)呈連續(xù)分布。 莖稈機械強度 的 變異系數(shù)最大為 %，穗長 的變異系數(shù)最小為 %。 親本及其 F4家系植株 莖 稈機械強度和 7 個穗型相關(guān)性狀的表型變異 親本 NG172 和日本晴及 F2 群體單 株衍生的 F4 家系 植株 莖 稈機械強度和 7 個穗型相關(guān)性狀的值見 ，親本 NG172 的穗彎曲度、穗長與有效穗數(shù)的平均值小于親本日本晴相應性狀的平均寧夏大學碩士學位論文 第三章 結(jié)果與分析 14 值，而莖稈機械強度、穗粒數(shù)、 穗著粒密度 、一次枝梗與二次枝梗的平均值均大于親本日本晴相應性狀的平均值， 8 個性狀在群體內(nèi)均呈雙向超親分離，且在群體內(nèi)呈連續(xù)分布。穗彎曲度的變異系數(shù)最大為 %，一次枝梗的變異系數(shù)最小為 %。 表 親本 NG172 和日本晴及