張亞平,蛋白質(zhì)組技術-資料下載頁
2025-05-14 04:31本頁面
【正文】 或圖譜 ? 雙雜交系統(tǒng)的 BD及 AD質(zhì)粒均接上cDNA庫，讓它們隨機表達蛋白 ? 通過檢測報告基因的表達可以證實一系列嶄新蛋白中兩兩間的相互作用 ? 如能證實在蛋白質(zhì) AB、 BC和 CD間都存在相互作用，據(jù)此可繪制出A→B→C→ D的蛋白間聯(lián)系圖譜 （四）、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性 1. 某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì) 。 雙雜交前刪除該部分，但應避免刪除相互作用的結構域 2. 某些蛋白在酵母中 不穩(wěn)定表達或不能準確定位 到胞核內(nèi)。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用 噬菌體顯示系統(tǒng) 。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內(nèi)無法進行。 有時 DNABD或 AD融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。 ? 4. 哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究 陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。 ? 1. 細菌雙雜交系統(tǒng) 直接在細胞質(zhì)內(nèi)研究蛋白之間相互作用，適用于不能進入細胞核的蛋白質(zhì)。 百日咳博代桿菌中腺苷酸環(huán)化酶催化結構域可分為 T18和 T25兩個相對獨立的功能單位 ? 3. 單雜交系統(tǒng) ? 用于研究蛋白質(zhì)與 DNA的相互作用 ? 檢測蛋白質(zhì)能否和 DNA結合 ? 篩選能和 DNA結合的蛋白質(zhì) 只用雙雜交系統(tǒng)中的 DNAAD質(zhì)粒，不用 DNABD質(zhì)粒，故稱為單雜交系統(tǒng) 待研究的蛋白質(zhì)可看作雙雜交系統(tǒng)中 GAL4的 BD結構域 將待研究蛋白質(zhì)基因與 DNAAD質(zhì)粒重組，以融合形式表達AD蛋白質(zhì) 重組質(zhì)粒轉入酵母細胞 酵母單雜交原理示意圖 ? 4. 反向雙雜交系統(tǒng) 鑒定導致蛋白質(zhì)不能相互作用的突變 鑒定能破壞蛋白質(zhì)相互作用的因子 采用反式選擇性報告基因 Ure3基因編碼的酶催化嘧啶類似物 5氟清酸轉化成細胞毒性物質(zhì)，使細胞死亡 兩種蛋白質(zhì)能相互作用， Ure3基因表達，細胞死亡 兩種蛋白質(zhì)不能相互作用， Ure3基因不能表達，細胞得以生長 ? 5. 三雜交系統(tǒng) 研究蛋白質(zhì)與 RNA的相互作用 X為能與 RNA特異結合的蛋白質(zhì)，其基因與DNABD質(zhì)粒重組，表達 BDX融合蛋白 待研究蛋白 Y基因與 DNAAD質(zhì)粒重組，表達ADY融合蛋白 另有質(zhì)粒轉錄特定的 RN 三種質(zhì)粒同時轉入酵母細胞 酵母三雜交原理示意圖 ? 三雜交系統(tǒng)中有三個雜交體 ? BDX和 ADY兩個融合蛋白不能直接作用，必須通過與 RNA結合，間接地激活報告基因 ? BDX的 X蛋白必有與 RNA結合的結構域 ? 檢測的是 Y蛋白和 RNA間有沒有作用 ? RNA可以換成蛋白質(zhì)、小分子多肽、有機配體等 ? 擴展三雜交系統(tǒng)的應用范圍
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