張亞平,蛋白質(zhì)組技術(shù)-資料下載頁
2025-05-14 04:31本頁面
【正文】 或圖譜 ? 雙雜交系統(tǒng)的 BD及 AD質(zhì)粒均接上cDNA庫，讓它們隨機(jī)表達(dá)蛋白 ? 通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)可以證實(shí)一系列嶄新蛋白中兩兩間的相互作用 ? 如能證實(shí)在蛋白質(zhì) AB、 BC和 CD間都存在相互作用，據(jù)此可繪制出A→B→C→ D的蛋白間聯(lián)系圖譜 （四）、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性 1. 某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì) 。 雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域 2. 某些蛋白在酵母中 不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位 到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用 噬菌體顯示系統(tǒng) 。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。 有時(shí) DNABD或 AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。 ? 4. 哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究 陽性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證。 ? 1. 細(xì)菌雙雜交系統(tǒng) 直接在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)研究蛋白之間相互作用，適用于不能進(jìn)入細(xì)胞核的蛋白質(zhì)。 百日咳博代桿菌中腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域可分為 T18和 T25兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的功能單位 ? 3. 單雜交系統(tǒng) ? 用于研究蛋白質(zhì)與 DNA的相互作用 ? 檢測(cè)蛋白質(zhì)能否和 DNA結(jié)合 ? 篩選能和 DNA結(jié)合的蛋白質(zhì) 只用雙雜交系統(tǒng)中的 DNAAD質(zhì)粒，不用 DNABD質(zhì)粒，故稱為單雜交系統(tǒng) 待研究的蛋白質(zhì)可看作雙雜交系統(tǒng)中 GAL4的 BD結(jié)構(gòu)域 將待研究蛋白質(zhì)基因與 DNAAD質(zhì)粒重組，以融合形式表達(dá)AD蛋白質(zhì) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞 酵母單雜交原理示意圖 ? 4. 反向雙雜交系統(tǒng) 鑒定導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能相互作用的突變 鑒定能破壞蛋白質(zhì)相互作用的因子 采用反式選擇性報(bào)告基因 Ure3基因編碼的酶催化嘧啶類似物 5氟清酸轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性物質(zhì)，使細(xì)胞死亡 兩種蛋白質(zhì)能相互作用， Ure3基因表達(dá)，細(xì)胞死亡 兩種蛋白質(zhì)不能相互作用， Ure3基因不能表達(dá)，細(xì)胞得以生長(zhǎng) ? 5. 三雜交系統(tǒng) 研究蛋白質(zhì)與 RNA的相互作用 X為能與 RNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，其基因與DNABD質(zhì)粒重組，表達(dá) BDX融合蛋白 待研究蛋白 Y基因與 DNAAD質(zhì)粒重組，表達(dá)ADY融合蛋白 另有質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄特定的 RN 三種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞 酵母三雜交原理示意圖 ? 三雜交系統(tǒng)中有三個(gè)雜交體 ? BDX和 ADY兩個(gè)融合蛋白不能直接作用，必須通過與 RNA結(jié)合，間接地激活報(bào)告基因 ? BDX的 X蛋白必有與 RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域 ? 檢測(cè)的是 Y蛋白和 RNA間有沒有作用 ? RNA可以換成蛋白質(zhì)、小分子多肽、有機(jī)配體等 ? 擴(kuò)展三雜交系統(tǒng)的應(yīng)用范圍
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