張亞平,蛋白質(zhì)組技術(shù)(完整版)
【正文】 10ng蛋白質(zhì)即可顯示出條帶。 雙向電泳技術(shù) 、 計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù) 。 去除樣本中的脫氧核糖核酸 (DNA ) , 核糖核酸 (RNA ) , 脂質(zhì)等； ? 在樣本加入尿素后避免加熱； ? 蛋白質(zhì)提取一般使用含有變性劑、表面活性劑、還原劑、固定 pH 梯度緩沖液 ( IPG buffer)。 質(zhì)量較輕的離子飛行速度快 ， 較早到達(dá)檢測(cè)器 ， 較重的離子飛行速度慢 ， 較晚到達(dá)檢測(cè)器 ， 離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比的平方根 (m／ z) 成正比 ， 通過(guò)檢測(cè)飛行時(shí)間來(lái)測(cè)定離子的質(zhì)荷比 。如 Y蛋白是未知蛋白，則需用 AD質(zhì)粒構(gòu)建 cDNA文庫(kù)。 ? 4. 篩選多肽類新藥 ? 將藥物作用的靶蛋白基因克隆在 BD載體上，待篩選的多肽藥物基因克隆在 AD載體上，從中篩選作用于靶蛋白的多肽類新藥 ? 5. 繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)或圖譜 ? 雙雜交系統(tǒng)的 BD及 AD質(zhì)粒均接上cDNA庫(kù)，讓它們隨機(jī)表達(dá)蛋白 ? 通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)可以證實(shí)一系列嶄新蛋白中兩兩間的相互作用 ? 如能證實(shí)在蛋白質(zhì) AB、 BC和 CD間都存在相互作用，據(jù)此可繪制出A→B→C→ D的蛋白間聯(lián)系圖譜 （四）、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性 1. 某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì) 。 ? 1. 細(xì)菌雙雜交系統(tǒng) 直接在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)研究蛋白之間相互作用，適用于不能進(jìn)入細(xì)胞核的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用 噬菌體顯示系統(tǒng) 。 ? 3. 從大腸桿菌中提取兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 ? 在缺少 Trp、 Leu和 His,含有 Xgal的培養(yǎng)基上篩選 ? 在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的藍(lán)色菌落證明 X蛋白和 Y蛋白能互相作用。 （一）、酵母雙雜交技術(shù)原理 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí) 真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 BD AD 組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開(kāi) 功能互相獨(dú)立 空間較近時(shí)表現(xiàn)活性 中間序列對(duì)活性無(wú)影響 酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 N端 C端 147AA 213AA BD AD LexA蛋白 單純皰疹病毒的 VP編碼區(qū) BD AD 大腸桿菌的 LexA蛋白 選擇酵母細(xì)胞作為雙雜交系統(tǒng)的宿主菌株： 2. 酵母細(xì)胞有很多的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，篩選陽(yáng)性克隆比較方便、容易。 第一向： 變性的等電聚焦電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離 第二向： SDS 聚丙烯酰胺電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行分離 （三）、雙向凝膠電泳過(guò)程中需要注意的問(wèn)題 蛋白質(zhì)樣品制備是關(guān)鍵 1） .盡可能地使蛋白質(zhì)組中的各種蛋白質(zhì)成分都溶解在裂解液中 2） . 防止制備過(guò)程中蛋白成分的降解與修飾 3） . 要保證蛋白質(zhì)徹底變性 4） .取材要有重現(xiàn)性：用細(xì)胞 不用組織 5） 裂解液中需加 ： 尿素?cái)嗔训鞍踪|(zhì)的氫鍵和疏水鍵 還原劑破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵 兼性離子去垢劑增加疏水性氨基酸殘基的溶解性 6） 整個(gè)制備過(guò)程需在低溫環(huán)境中進(jìn)行，在裂解液中加入蛋白酶抑制劑
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