【導讀】β-半乳糖苷酶進行了測定。單菌落的最佳生長時間是10h，最佳接種量是%，制作用最強，少量Cu2+就可使酶失活。本實驗還進行了β-半乳糖苷酶的固定化實驗。以海藻酸鈉為栽體、戊二醛為。結果表明，4％的海藻酸鈉，在溫度37℃、pH6~7、氯化鈣濃度1％、戊二醛濃度%下對乳糖酶的固定化率最高。酶促反應特性測定結果表明，固。與非固定化乳糖酶大致相同。但固定化酶珠體機械強度較差，尚待改進。

　　

【正文】 。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進行反應，這時的固定化顆粒和流體可以看作是均勻混合的流體。流化床反應器具有傳熱與傳質(zhì)特性好、不堵塞、壓降較小等優(yōu)點，也很適合排氣供氣的反應，但它需要較高的流速才能維持粒子的充分流態(tài)化，故放大較困難。目前，流化床反應器主要被用來處理一些粘度高的液體和含有固體顆粒的底物，如用于水解牛奶中的蛋白質(zhì)。 圖 433 流化床反應器 中空纖維反應器 (Hollow Fiber Reactor) 中空纖維反應器是把酶結合于半透性的中空纖維，這種中空纖維的半透膜，只允許底物和產(chǎn)物等小分子量的物質(zhì)通過，而分子量較大的酶則不能 ，如圖 434所示 。它可以提供較大的催化表面，結構類似于列管換熱器。在這種反應器中，酶與中空纖維可按不同的方式安排。例如，酶可被包埋于中空纖維內(nèi)，然后再把纖維束放置于反應器內(nèi)。操作時，底物流經(jīng)纖維外表面，并擴散進入纖維內(nèi)腔，再在腔內(nèi)發(fā)生酶促反應，生成的反應產(chǎn)物又擴散返回流動主體。另一種方式是把酶保留在纖維的外側 ，而底物則流經(jīng)纖維內(nèi)腔。其缺點是制作成本高，膜容易堵塞。此外還有螺旋卷膜式反應器以及不同反應器結合的類型，但并不存在一種通用的、理想的反應器。在生產(chǎn)中，必須根據(jù)具體情況，針對系統(tǒng)的特點，選擇使東北電力大學學士畢業(yè)論文 23 用適合的反應器。 圖 434 中空纖維反應器 固定化乳糖酶國內(nèi)外研究進展 國外研究進展 美國、日本、意大利等國對固定化 β半乳糖苷酶分解乳糖進行了廣泛的研究。Bodalo 等人對不同固定化 β半乳糖苷酶進行了比較，他們所選用的固定化方法有：多孔玻璃共價結合法、 GCP醛交聯(lián)法、 GCP芳香胺交聯(lián) 法、凝膠包埋法以及物理吸附法等。具體結果如表 4 所示： 固定化方法 Vmax（ u/ml） Km（ mM） 相對活性（ %） 酶活力（ U） GCP交聯(lián)法 GCP芳香胺交聯(lián)法 卡拉膠包埋法 物理吸附法 游離酶 / / 可見 GCP 一醛交聯(lián)法效果最好。 Saito 和 Yoshida(1994)用多孔陶瓷作載體固定 β半乳糖苷酶，固定化酶 70℃處理 3 小時，活力沒有下降。固定化酶的特性幾乎與游離酶相同，在巴氏消毒牛奶中 65℃ 固定化酶的半衰期為 450 小時，體現(xiàn)了工業(yè)用于生產(chǎn)低乳糖牛奶的前第 4 章 酶的固定化 24 景。 Papayannokos 和 Markas(1993)將黑曲霉來源的 β半乳糖苷酶通過吸附和分子內(nèi)交聯(lián)固定在多孔陶瓷上，固定化后沒有酶脫落現(xiàn)象。固定化酶水解乳糖的最適 pH 和最適溫度同游離酶相同。固定化酶的半衰期是 180 天，而游離酶僅為 24天。 Tomoska 和 Gemeiner(1995)選用聚乙烯亞胺和戊二醛活化的果 膠酸鈣 (CPG)和海藻酸鈣 (CAG)作載體固定克魯維酵母屬 Marxianus CCYeSY2。在半連續(xù)反應器中循環(huán) 25 次以上，水解率能夠維持在 80%以上。固定化細胞在 4℃ 儲存 2 個月 ， 水解效率不變。 Peterson，等將來源于米曲霉的乳糖酶固定在由聚氯乙烯和硅膠組成的毛細管填充床上，在 30℃ ，停留時間 7min， 80%的脫脂乳能被水解。 用纖維素包埋酵母乳糖酶已有工業(yè)規(guī)模應用，用其間歇處理預先超高溫消毒的牛奶。采用 Coming Glass Systerm 用鹽酸把經(jīng)巴氏滅菌的待處理液調(diào) pH 值為，通過酶反應 器反應約 15min，最初反應溫度為 37℃ ，逐漸升高到 60℃ ，以補償酶活力的損失。在 、 30~35℃ 的條件下處理濃縮乳清，乳清濃縮程度取決于終產(chǎn)物的抑制作用和反應器的壓降，所用固定化酶的裝置曾成功地運轉(zhuǎn)了兩年。每日循環(huán)一次， 20 小時進行水解， 4 小時用于清洗。 Millert 根據(jù)乳糖酶與乳糖分子的大小不同，牛奶先經(jīng)過超濾，濾過液 (主要是乳糖 )與乳糖酶在反應器中反應，然后再經(jīng)過一次超濾，乳糖、葡萄糖、半乳糖等小分子物質(zhì)通過，而大分子的乳糖酶被截流住，重新回到反應器中繼續(xù)循環(huán)使用，第二次的濾過液和第一次的濾 過液混合，就制成低乳糖牛奶。該系統(tǒng)連續(xù)反應 6 周，總酶的活性下降不明顯，在 10℃ 下反應，可減少微生物的污染 [15]。 國內(nèi)研究進展 我國的學者對 β半乳糖苷酶的固定化也展開了一些研究，但尚未見到進行工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖奶的報道。 李文英等人 (1990)對利用不同載體，不同方法固定化的 β半乳糖苷酶活力進行了比較，實驗結果顯示聚丙烯酰胺凝膠包埋活力回收率高。李緒淵等人將來自鷹嘴豆 B 一半乳糖苷酶固定在聚丙烯酰胺上，活力回收率為 72%。與游離酶相東北電力大學學士畢業(yè)論文 25 比具有更寬的 pH 值范圍和更好的熱穩(wěn)定性。凍干固定化酶室溫保存 60 天，仍具有較高活力，重復使用數(shù)次后，仍具有操作穩(wěn)定性，酶活力沒有損失。 孫淑芳等人 (1999)將 β半乳糖苷酶固定在 D202 載體上，用戊二醛作交聯(lián)劑，與游離酶相比具有更寬的 pH 范圍。反應動力學參數(shù) Ea、 Km 變大， Vmax 變小。該來源的酶具有水解牛奶中乳糖特點。潘道東 (1991)，用卡拉膠包埋法制備固定化脆壁酵母 β半乳糖苷酶，活力回收率可達 83%，可以在實驗條件下有效水解乳清、脫脂乳和全脂乳中的乳糖，在 45℃ 下，水解半衰期均在 1 69200 小時，但是卡拉膠的機械強度差，不適合工業(yè)化應用。 β半 乳糖苷酶的固定 包埋材料選擇 包埋材料有瓊脂、瓊脂糖、 k卡拉膠、明膠、海藻酸鈉、聚丙烯酰胺、纖維素等，其中海藻酸鈉包埋法簡單、無毒、安全、價格低廉，材料易得，是最常用的方法。本文以海藻酸鈉為包埋載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對乳糖酶進行固定化嘗試，探討了固定化的最適條件及固定化酶的部分性質(zhì)。 β半乳糖苷酶固定方法 將一定濃度海藻酸鈉與酶液按 l： l 比例混合，吸入 7 號注射器內(nèi)，再逐滴滴入氯化鈣溶液中，即成規(guī)則球形，球體在一定范圍內(nèi)不受滴落高度、速度及接觸溶液濃度的影響 ，操作完畢后，放入 4℃ 冰箱中硬化 2h，過濾洗滌，加入戊二醇溶液交聯(lián) 4h，洗滌，抽濾 3 次，測定酶活力。 固定酶活力測定 與 所描述的酶的測定方法相同，只是不加游離酶，而加固定化酶。 第 4 章 酶的固定化 26 固定化的最適條件 海藻酸鈉濃度的確定 分別配制濃度為 1%， 2%， 3%。 4%， 5%的海藻酸鈉，各取 5mL，放置于 5個燒杯中，每個燒杯中各加入 5mL 酶液，混勻靜置 30min，用注射器吸取 lmL混合液逐滴滴入 20mL 2％的 CaCl2溶液中，于室溫下固定 30min，用蒸餾水洗滌，抽濾三次，獲得固定化酶。將固定化酶加入 5mL ONPG 底物溶液中（ 37℃ 預熱），反應 10min 后加入 2mL Na2CO3 溶液中止反應，在離心機中以 120/rnin 離心2~3min，取上清液在 420nm 下測定吸光值，結果見圖 461?？芍Ｔ逅徕c固定化酶的酶活有不同程度損失，海藻酸鈉濃度低時，酶泄漏嚴重，清洗酶珠時，酶損失較多，酶活力下降，海藻酸鈉濃度高時，微環(huán)境效應和擴散陰力對反應影響更大。且不易操作，很難將酶液從注射器中擠出，綜合各種因素，確定海藻酸鈉濃度為 4％，酶液與海藻酸鈉的體積比為 l： l(海藻酸鈉實際濃度為 2％ )。 01 2 3 4 5 6海藻酸鈉濃度（%）吸光值 圖 461 海藻酸鈉濃度對固定化酶酶活的影響 CaCl2 濃度的確定 分別配置 濃度 為 1%， 2%， 3%， 4%， 5%的 CaCl2溶液各 20mL 置于 燒杯 中，在相同條件下用 4％海藻酸鈉進行酶固定化處理，固定時間為 1h，固定化酶與底物精確反應 10min，加入 Na2CO3溶液中止反應 ， 測吸光值，結果見 462?？?以看出 l% CaCl2濃度固定化酶的酶活高些，確定為最適濃度。 東北電力大學學士畢業(yè)論文 27 01 2 3 4 5 6CaCl2濃度 （%）吸光值 圖 462 CaCl2 濃度 固定化酶酶活的影響 固定化時間的確定 取 4％的海藻酸鈉與酶液各 10mL，混勻靜置 1h，取 6 個燒杯各加入 20mL l％CaCl2溶液，分別用注射器吸取 1mL 混合液滴入燒杯中，在不同時間 (0， ，1h， ， 2h， )抽濾得固定化酶，酶與底物精確反應 10min，加入 Na2CO3溶液中止反應，測酶活。結果見圖 463。當固定化時間為 0 時，珠體破碎溶解，無法測酶活，最終確定固定化時間為 。 00 1 2 3固定化時間吸光值 圖 463 固定化時間對固定化酶酶活的影響 戊二醛交聯(lián)試驗 海藻酸鈉凝膠法雖操作方便，但凝膠網(wǎng)格大，且凝膠鈣化過程鈣離子從凝膠外部逐漸向內(nèi)擴散，在凝膠顆粒中鈣離子分布不均勻，致使凝膠內(nèi)軟外硬，強度不夠，包埋不緊密，固化酶易破碎，大部分酶隨著批次轉(zhuǎn)化從凝膠的網(wǎng)格中或從第 4 章 酶的固定化 28 破碎處泄漏流失，因而酶活隨之急劇下降，操作穩(wěn)定性差，半衰期短。在實際應用中，一種固定方法常不能達到理想的結果，往往幾種固定方法聯(lián)合使用。戊二醛作為一種雙功能交聯(lián)劑，可以使海藻酸鈉分子發(fā)生交聯(lián)， 同時也可使酶交聯(lián)在載體上，強化海藻酸鈉的機械強度和固定化酶的穩(wěn)定性 [16]。 起初取 1%， 2%， 3%， 4%， 5%戊二醛作為交聯(lián)劑，反應后發(fā)現(xiàn)溶液無顯著變色現(xiàn)象，表明高濃度的戊二醛將導致酶活力下降，這可能是因為酶分子活性基團被戊二醛過多地修飾，遂分別取 %， %， %， %的戊二醛作為交聯(lián)劑，將 lmL 酶液和海藻酸鈉混合液滴入由 10mL CaCl2溶液和 l0mL 戊二醛溶液組成的混合溶液中，反應 15min，結果見圖 464，從中可見戊二醛濃度在 %時聯(lián)合固定化酶的活力最高，交聯(lián)劑濃度過高時， 使酶本身變性失活，酶活力下降。因此，確定最適戊二醛濃度為 %。 0 戊二醇濃度（%）吸光值 圖 464 戊二醇濃度對固定化酶酶活的影響 固定化酶的酶學性質(zhì) 固定化酶的最適 pH 在兩支試管中各加入 5mL ONPG 底物溶液，一支加入游離酶 ，一支加入 固定化酶，在不同 pH(3， 4， 5， 6， 7， 8， 9)下反應 10min 滅活，測吸光值， 計算相對酶活， 結果見圖 471。 由圖可知，固定化酶的最適 pH 在 6~7，在其范圍內(nèi)固 定化酶能保持游離酶活性的 80%左右 。在 pH6 或 pH7 時，固定化酶活力迅速下降，可能是過酸或過堿的環(huán)境使酶的活性中心部位基團發(fā)生了不東北電力大學學士畢業(yè)論文 29 可逆的變化 。 0204060801001203 4 5 6 7 8 9pH相對酶活% 圖 471 固定化酶 的最適 pH 固定化酶的最適溫度 取兩支試管，均加入 5mL ONPG 底物溶液，一支加入游離酶 ，一支加入 固定化酶，在不同溫度 (30℃ ， 35℃ ， 40℃ ， 45℃ ， 50℃ ， 55℃ ， 60℃ )下反應 10min 滅活，測吸光值， 計算相對酶活， 結 果見圖 472?？芍潭ɑ概c游離酶的最適溫度 都在 35~40℃范圍內(nèi)。 02040608010030 35 40 45 50 55 60溫度℃相對酶活% 圖 472 固定化酶的最適溫度 固定化酶的催化反應機理探討 固定化酶反應體系屬非均相催化反應。通常基質(zhì)溶于連續(xù)相水中，固定化酶第 4 章 酶的固定化 30 懸浮于其中，以單基質(zhì)反應為例 (S—P)，基質(zhì) S 從反應液主體傳遞到固定化酶微粒外表面，然后擴散到粒子的酶分子上，而生成物 P 則剛好與此途徑相反。 固定化酶對反應體系的影響 液體酶和固定化酶的基質(zhì) (S)和酶 (E)在反應前的分布，如模擬圖 481： 圖 481 反應開始前酶分子周圍基質(zhì)的分布 對液體酶反應，當酶濃度為 102M 時，酶與基質(zhì)問最大平均距離為 200A，對于固定化酶反應，若固定化酶顆粒直徑為 時，則與粒子距離最近的基質(zhì)與載體中心的酶的距離為 ，為液體酶的 1000 倍，因此固定化酶反應的物質(zhì)傳遞對反應速度的影響變得更為重要了。 影響固定化酶的動力學因素 酶分子構象的改變和載體的屏蔽效應 前一種影響是酶分子在固定化過程中發(fā)生了某種扭曲，可能使酶分子拉長，改變酶 活性部位的三維結構，從而改變酶活性，這兩種原因都直接導致了酶與底物結合能力或酶催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變，而影響酶活性。 微環(huán)境效應 (即分配效應 ) 微環(huán)境是指固定化酶附近的環(huán)境區(qū)域，而主體溶液則稱為大環(huán)境 ， 反應系統(tǒng)東北電力大學學士畢業(yè)論文 31 中由于載體和底物的疏水性，親水性以及靜電作用，引起微環(huán)境和大環(huán)境之間不同的性質(zhì)，這樣就形成了分配效應。分配效應使得底物或其他各種效應物在微環(huán)境與大環(huán)境之間不均勻分布，從而影響酶反應速度，實驗測定的是大環(huán)境的濃度，而反應本質(zhì)行為的是微環(huán)境中的濃度。 擴散阻力 固定化酶的反應 體系和液體酶不同，即底物