固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù)-資料下載頁
2025-05-26 05:49本頁面
【正文】 制備方法與固定化酶相類似，但以吸附法、包埋法應(yīng)用最多。其它方法也有嘗試，如超過濾、共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)法等。 一、包埋法 載體 ：瓊脂、 明膠、 聚丙烯酰胺凝膠、 卡拉膠、 血纖維蛋白、 環(huán)氧樹脂等。 明膠包埋法 :明膠 — 戊二醛包埋鏈霉菌細(xì)胞 實(shí)例 :葡萄異構(gòu)酶產(chǎn)生菌 — 玫瑰暗黃鏈霉菌固定化 （ 1）戊二醛處理菌體細(xì)胞 ： 10克菌體（濕重），%戊二醛，混勻。 （ 2）明膠液配制 ： 1克明膠，加 8ml 水溶解。 （ 3）固定制膜 ：混合（ 1）和（ 2），鋪成 23mm厚的膜， 05℃ 凝固 1h 。 （ 4）戊二醛處理 ： %戊二醛溶液 75ml，浸泡2448h。 （ 5）成型 ：機(jī)械破碎，成 10目大小，蒸餾水洗滌待用。 聚丙烯酰胺凝膠包埋法 大腸桿菌和產(chǎn)氨短桿菌已分別用于工業(yè)化生產(chǎn) L天冬氨酸 、 L蘋果酸 。 聚丙烯酰胺凝膠包埋大腸桿菌（ L天冬氨酸酶）： （ 1）材料準(zhǔn)備： 菌懸液： E. coli ATCC II303， 1kg菌體（濕重）加2L生理鹽水，冷至 8℃ 。 單體溶液： 丙烯酰胺 750g， N,N’甲叉雙丙烯酰胺40g，溶于 , 冷至 8℃ 。 （ 2）固定化 ⅰ 混合菌懸液與單體懸液 ,加入催化劑 :100ml25%β 二甲基丙腈 ,500ml1%過硫酸鉀。 ⅱ 聚合： 2025℃ ， 1520min（聚合反應(yīng)約在 5min后開始。溫度升高，當(dāng)溫度升至 30℃ 時(shí)，迅速用冰水冷卻）。 ⅲ 成型： 切成 34mm顆粒，水洗。 （ 3）活化細(xì)胞 固定化細(xì)胞在含有 1mM Mg2+的 1N反丁烯二酸銨（）中， 37℃ 2448h。（天冬氨酸酶活力可提高 910倍）。 海藻酸鹽包埋法 海藻酸為 d甘露糖醛酸 和 l古羅糖醛酸 通過 1,4糖苷鍵聯(lián)接而成的聚合物。 （ 1）海藻酸鈉溶液配制： 6g溶于 96ml水（約 6%濃度）。 （ 2）混合菌體： /ml (30%W/V)。 （ 3）固化和成型： 固化液（含 Ca2+、 Zn2+、 Al3+等多價(jià)陽離子溶液，如），將海藻酸鈉與菌體的混合液用針形管滴入固化液中。 （ 4）硬化與洗滌： 顆粒放置于 CaCl2浸泡 1小時(shí)進(jìn)一步固化。 缺點(diǎn)： 在高濃度的電解質(zhì)（ K+、 Na+等）中顆粒不穩(wěn)定。 Ca2+等多價(jià)離子會(huì)在磷酸緩沖溶液沉淀，導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度降低，和重新溶解。 二、吸附法 細(xì)胞表面帶有電荷，因此可以通過離子交換或吸附作用結(jié)合于載體。該法簡便，易于再生，但結(jié)合力弱，易脫落。工業(yè)應(yīng)用上較少。 陰離子樹脂： 固定放線菌（葡萄糖異構(gòu)酶，生產(chǎn)果糖） DEAE纖維素： 固定巨大芽 孢桿菌（青霉素?；?，生產(chǎn) 6APA）。 三、其它 交聯(lián)法 有少量嘗試，如含有天冬氨酸酶的大腸桿菌曾用多種雙功能試劑交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)只有戊二醛交聯(lián)能獲得有活力的制劑，但所得固定化細(xì)胞顆粒太細(xì)，機(jī)械強(qiáng)度差。 共價(jià)結(jié)合法： 少數(shù)細(xì)菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亞胺脫水與 CM纖維素連接。細(xì)胞無生存能力，但仍保留組氨酸氨裂合酶的活性，故引起人們注意，有等進(jìn)一步的發(fā)展。 第三節(jié) 固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用 一、在工業(yè)方面的應(yīng)用 氨基酸工業(yè) （ 1）利用固定化酰化酶（細(xì)胞）生產(chǎn) L氨基酸 — DL氨基酸拆分 工業(yè)上化學(xué)合成氨基酸都是無光學(xué)活性的 DL型外消旋混合物。須將它進(jìn)行光學(xué)拆分以獲得 L型氨基酸。 外消旋氨基酸拆分方法 :物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，其中以酶法最有效，能夠生產(chǎn)純度較高的 L氨基酸。反應(yīng)式如下： （ 2）氨基酸的轉(zhuǎn)化生產(chǎn) 門冬氨酸的生產(chǎn)：利用固定化門冬氨酸酶（細(xì)胞， E. coli）生產(chǎn) HOOCCH=CHCOOH+NH3— →L 門冬氨酸 反丁烯二酸 L丙氨酸、 L鳥氨酸、 L瓜氨酸的生產(chǎn)：利用固定化門冬氨酸 β 脫羧酶（細(xì)胞，惡臭假單胞菌）生產(chǎn)，其原理是， L門冬氨酸 —— →L 丙氨酸 +CO2 L精氨酸 —— →L 瓜氨酸 (冷凍固定化細(xì)胞 ) —— →L 鳥氨酸（不冷凍） （ 3）固定化細(xì)胞直接生產(chǎn)氨基酸 谷氨酸、組氨酸、精氨酸已通過這種方法生產(chǎn)。 抗生素工業(yè) （ 1）從青霉素生產(chǎn)青霉烷酸（ 6APA） 青霉素是 β內(nèi)酰胺類抗生素，都有一個(gè)共同母核 —— 6APA。改變其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，則可改變其抗菌譜、水溶性、耐酸性、和抗 β內(nèi)酰胺酶的能力。在發(fā)酵法中，對(duì)不同的側(cè)鏈前體進(jìn)行發(fā)酵以生產(chǎn)不同的青霉素進(jìn)行了廣泛的研究，獲得近百種，但成功的只有青霉素 V，其它則因產(chǎn)率低、產(chǎn)物復(fù)雜等原因而無實(shí)用價(jià)值。 半合成是將 6APA用不同側(cè)鏈羧酸?；?，進(jìn)一步合成了許多廣譜、耐酸、抗 β內(nèi)酰胺酶、毒性低、適合不同用途的新抗生素，如氨芐青霉素、對(duì)羥芐青霉素、苯甲異惡 唑青霉素、對(duì)羥氨芐青霉素 …… 等。 獲得半合成起始物 6APA是半合成各種青霉素的關(guān)鍵。發(fā)酵法生產(chǎn) 6APA產(chǎn)量低，分離困難。故直接發(fā)酵法被排除。 50年代酶催化水解青霉素生產(chǎn) 6APA成功。已工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。使用酶法生產(chǎn) 6APA產(chǎn)率很低。固定化細(xì)胞（酶）可提高 6APA的產(chǎn)率（ 100500倍）。反應(yīng)原理是： （ 2）固定化法生產(chǎn) 7— ACA(7氨基頭孢霉烷酸 )和7ADCA(7氨基 3脫乙酰氧基頭孢霉烷酸 ) 發(fā)酵法生產(chǎn)的主要產(chǎn)物是頭孢霉素 C，其母核是 7ACA。 7ACA是制備半合成抗生素頭孢噻吩、頭孢唑啉的起始化合物。 可由頭孢霉素 C經(jīng) Ps. pudita(惡臭假單胞菌 )產(chǎn)生的酰化酶水解生成 7ACA。 也有兩步法的研究：頭孢霉素 C——Trigonopsis variabilis生物轉(zhuǎn)化為谷氨酰 7ACA—— 再由 Ps. sp 或 Comamonas 7ACA。 （ 3）催化合成新的青霉素和頭孢霉素 6APA（ 7ADCA） +側(cè)鏈衍生物 —— 固定化?；福?xì)胞） —— 新的青霉素或頭孢霉素。 但由于底物、產(chǎn)物抑制作用、反應(yīng)的可逆性，反應(yīng)產(chǎn)率低，與化學(xué)合成法相比優(yōu)越性不突出。個(gè)別產(chǎn)率較高的值得進(jìn)一步探索。 （ 4）固定化直接發(fā)酵生產(chǎn)抗生素 青霉素、桿菌肽。 糖和醇類的生產(chǎn) 果葡糖漿的生產(chǎn) 山梨糖 —— 山梨醇 乙醇、異丙醇、正丁醇等 。 其它 有機(jī)酸：反丁烯二酸 —— L蘋果酸。萘 ——水楊酸等 甾體轉(zhuǎn)化：氫化可的松 —— 氫化波尼松 生產(chǎn)核酸、核苷酸、輔酶等 二、在生化分析上的應(yīng)用 酶電極、微生物傳感器（如致癌物的篩選等）
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