固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù)-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 基、賴(lài)氨酸殘基的 ε氨基 羧基 ： C端羧基、門(mén)冬 β羧基、谷氨酸 γCOOH 巰基 ：半胱氨酸 SH 羥基 ：酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的 OH 苯環(huán) ：苯丙氨酸、酪氨酸 咪唑基 ：組氨酸 吲哚基 ：色氨酸 在進(jìn)行一種酶的固定時(shí)，首先要考慮酶的氨基酸組成、活性中心的氨基酸、立體結(jié)構(gòu)及專(zhuān)一化學(xué)修飾對(duì)酶活性和影響。 載體選擇時(shí)的注意問(wèn)題： (1) 理化性質(zhì)：應(yīng)是親水性質(zhì)的，疏水載體往往對(duì)酶有變性的作用。 (2)合成高聚物：尼龍、多聚氨基酸、乙烯 順丁烯二酸酐共聚物等。 pH89 芳族重氮基具有疏水性，趨向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中區(qū)域。 （ 3） ABSE纖維素制備： 加堿性纖維素、活化劑溶液于反應(yīng)器，熱水浴保持溫度達(dá) 60℃ ，立即用 NaOH調(diào)節(jié)至 pH13,溫度升至 80℃ ,維持 pH13保溫45min。 D. 洗滌： 固定化酶以 50ml 3%NaCl攪拌洗滌 3次，水洗滌 2次后，懸浮于 CaCl2溶液中，冰箱保存?zhèn)溆谩? 反應(yīng)原理 即 CM載體在酸或三氟化硼催化下以 甲醇酯化 ，然后用 水合肼肼解 ，再通過(guò) 亞硝酸活化 成疊氮化合物。 亞氨基碳酸鹽 對(duì)蛋白的氨基的親核反應(yīng)十分敏感，生成 N取代異脲 、 N取代亞胺碳酸酯 、 N取代氨基甲酸酯 的衍生物。過(guò)量試劑可在 pH11條件下，用過(guò)量漂白粉處理一晚后棄去。 較濃的（ 40%左右的）：超燙，感覺(jué)喝燙稀飯了，然后微甜感和痛感并存，持續(xù) 2天才退（ 98%的純正濃硫酸不敢喝）。 濃：含在嘴里十分的辣 (可能是已經(jīng)反應(yīng)起來(lái)了 ) 然后舌頭燒壞 ,呈黃色 ,肉腐爛， 1個(gè)月不能說(shuō)話 ,口里有赤痛感而且舌頭麻木 有辛辣感半年后出院 ,說(shuō)話變得不準(zhǔn) ,味覺(jué)幾乎消失 ,嘴部留下疤痕（這東西對(duì)蛋白質(zhì)的反應(yīng)不是鬧著玩的 …… ）。 無(wú)水酒精 嘴里完全沒(méi)味道，之后花露水的味道在鼻子里揮之不去。 H2O2（雙氧水） 特辣，趕緊吐了，之后就沒(méi)什么事情了 。味道上沒(méi)什么感覺(jué)，但是非常嗆，吸進(jìn)去很少，但是咳了一整個(gè)下午，一直到吃晚飯都反胃，印象深刻啊 硅烷化法 無(wú)機(jī)載體機(jī)械強(qiáng)度好、耐受有機(jī)溶劑的作用和微生物侵蝕能力強(qiáng)，可以再生，在廣泛范圍的 pH、壓力、溫度下載體不改變結(jié)構(gòu)，同時(shí)來(lái)源豐富、價(jià)格低廉。其產(chǎn)物烷胺基玻璃是帶有有機(jī)功能團(tuán)（氨基）的無(wú)機(jī)載體。 利用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白分子間的交聯(lián)，酶分子與多功能試劑間形成共價(jià)鍵，得到立體交聯(lián)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。可能過(guò)程如下： 多功能試劑制備固定化酶，可進(jìn)一步分為： （ 1）單獨(dú)與酶使用。 (載體交聯(lián)法 ) 直接交聯(lián)酶法雖然操作簡(jiǎn)便，但固定化顆粒太細(xì)，活力往往不高。 方法 ：混合單體、交聯(lián)劑和酶（于緩沖溶液中進(jìn)行），然后加入催化劑，系統(tǒng)開(kāi)始聚合。 ? 卡拉膠：鹿角菜膠、角叉菜膠。 海藻酸：來(lái)自海藻的由 D甘露糖醛酸和 L古洛糖醛酸組成的多糖。有助懸、增稠、乳化、粘合等作用。 （ 4） 珠狀聚合包埋 過(guò)程：酶、保護(hù)劑、單體、交聯(lián)劑、聚合催化劑混合后，立即在疏水相（一種乳化劑，與水有同樣密度）的有機(jī)溶劑中分散成珠狀凝膠。 ③ 疏水相： 1ml山梨聚糖倍半油酸與 400ml甲苯 氯仿（ 290： 110）混合 . ④ 反應(yīng)與成型： ② 與 ① 混合后迅速加到疏水相，攪拌分散。又分為 界面沉淀法 和 界面聚合法 。 微囊直徑與乳化的程度有關(guān)，乳化分散的好壞又與 攪拌的速度 有關(guān)。 硝酸纖維素溶液： 4%硝酸纖維素的乙醇 乙醚（ 1： 3）溶液，蒸發(fā)至原先重量的 20%，然后加乙醚至原體積，重新溶解。 ② 加成膜材料，乳化： 25ml硝酸纖維素溶液，繼續(xù)磁力攪拌60秒。 4℃ 放置 30min。 ⑥ 洗滌： 1%Tween 20反復(fù)洗滌，直到不再含有血紅蛋白和苯甲酸正丁酯氣味。 主要過(guò)程 : (以尼龍膜制備為例 ) 酶液與 聚合單體 混合：酶溶于 10%血紅蛋白溶液，加已甲叉二胺水溶液。 表 1固定化化酶制備方法及特性比較 特性 制備方法 離子交換吸附 物理吸附 共價(jià)結(jié)合 交聯(lián)法 包埋法 制備難易 易 易 難 難 難（中） 酶活力 高 低 高 中 高 底物特異性 不變 不變 易變 易變 不變 酶與載體結(jié)合能力 中 弱 強(qiáng) 強(qiáng) 強(qiáng) 再生性 可能 可能 不可 不可 不可 使用普遍性 高 低 中 中 高 成本 低 低 高 中 中 50 四、固定化載體材料新進(jìn)展 （ 1）傳統(tǒng)載體材料的改性 利用有機(jī)聚合物對(duì)傳統(tǒng)無(wú)機(jī)載體材料改性修飾： ? 右旋糖苷對(duì)硅膠表面改性修飾可改善其表面的生物親和性， 用于固定 β葡萄糖苷酶時(shí)可大大提高了酶的負(fù)載量。 ? 一種聚合物對(duì)另一種聚合物的表面改性修飾： Ye 等先合成聚丙烯腈 順丁烯二酸超濾中空纖維膜，用 1乙基 3(3二甲胺基丙基 )碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC ? 磁性高分子微球可以通過(guò)共聚、表面改性等化學(xué)反應(yīng)在微球表面引入多種反應(yīng)性功能基，對(duì)酶進(jìn)行共價(jià)連接固定。 ? 先將木瓜蛋白酶與 N羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯 (NAS)反應(yīng)，再利用自由基溶液聚合反應(yīng)，制備的固定化木瓜蛋白酶具有 pH敏感相分離特性，兼有溶液酶和固相酶兩者的優(yōu)點(diǎn) 58 ? 導(dǎo)電載體： ? 導(dǎo)電載體具有一定的電子傳導(dǎo)性，作為固定化酶的一類(lèi)特殊載體，在基于酶電極的生物傳感器領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。沿用了固定化酶的方法，但其應(yīng)用速度超過(guò)的固定化酶。 （ 4）制備成本低。其它方法也有嘗試，如超過(guò)濾、共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)法等。 （ 3）固定制膜 ：混合（ 1）和（ 2），鋪成 23mm厚的膜， 05℃ 凝固 1h 。 聚丙烯酰胺凝膠包埋大腸桿菌（ L天冬氨酸酶）： （ 1）材料準(zhǔn)備： 菌懸液： E. coli ATCC II303， 1kg菌體（濕重）加2L生理鹽水，冷至 8℃ 。溫度升高，當(dāng)溫度升至 30℃ 時(shí)，迅速用冰水冷卻）。 海藻酸鹽包埋法 海藻酸為 d甘露糖醛酸 和 l古羅糖醛酸 通過(guò) 1,4糖苷鍵聯(lián)接而成的聚合物。 （ 4）硬化與洗滌： 顆粒放置于 CaCl2浸泡 1小時(shí)進(jìn)一步固化。該法簡(jiǎn)便，易于再生，但結(jié)合力弱，易脫落。 共價(jià)結(jié)合法： 少數(shù)細(xì)菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亞胺脫水與 CM纖維素連接。 外消旋氨基酸拆分方法 :物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，其中以酶法最有效，能夠生產(chǎn)純度較高的 L氨基酸。在發(fā)酵法中，對(duì)不同的側(cè)鏈前體進(jìn)行發(fā)酵以生產(chǎn)不同的青霉素進(jìn)行了廣泛的研究，獲得近百種，但成功的只有青霉素 V，其它則因產(chǎn)率低、產(chǎn)物復(fù)雜等原因而無(wú)實(shí)用價(jià)值。故直接發(fā)酵法被排除。固定化細(xì)胞（酶）可提高 6APA的產(chǎn)率（ 100500倍）。 也有兩步法的研究：頭孢霉素 C——Trigonopsis variabilis生物轉(zhuǎn)化為谷氨酰 7ACA—— 再由 Ps. sp 或 Comamonas 7ACA。 （ 4）固定化直接發(fā)酵生產(chǎn)抗生素 青霉素、
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