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生物化學(xué)脂類章節(jié)考點(diǎn)總結(jié)-資料下載頁

2024-08-30 15:42本頁面

【導(dǎo)讀】不溶于水而能被乙醚、氯仿、苯等非極性有機(jī)溶劑抽提出的化合物,統(tǒng)稱脂類。萜類和甾類及其衍生物:不含脂肪酸,都是異戊二烯的衍生物。能,植物的蠟質(zhì)可以防止水分的蒸發(fā)。不飽和脂肪酸有順式和反式兩種異物體。但生物體內(nèi)大多數(shù)是順式結(jié)構(gòu)。酰基團(tuán)能促進(jìn)膜蛋白與疏水環(huán)境間的相互作用。哺乳動(dòng)物既可以從食物中獲得大部分脂肪酸,也可以合成飽和脂肪酸和一些單不飽和脂肪酸。但是,哺乳動(dòng)物不能合成多不飽和脂肪酸,稱為必需脂肪酸。花生四烯酸可由亞油酸在體內(nèi)合成。完全皂化1克油脂所需KOH的毫克數(shù),稱皂化值。用來評(píng)估油脂的質(zhì)量。100克油脂吸收碘的克數(shù)。是一大類由許多哺乳動(dòng)物組織產(chǎn)生的激素類的物質(zhì)。它們只在產(chǎn)生的器官中起作用,所以稱。為自泌調(diào)控分子,而不是激素。碳單位、引入兩個(gè)雙鍵。細(xì)胞趨向破壞組織。

  

【正文】 不同亞基 血紅蛋白 α 2β 2 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu) (序列 )中含有形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的全部需的信息,一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)及功能。 二、 一級(jí)結(jié)構(gòu)的要點(diǎn) 蛋白質(zhì)主鏈由氨基酸以酰胺鍵連接,多肽的線性結(jié)構(gòu)叫肽鏈,組成肽鏈的氨基酸叫氨基酸殘基。 一級(jí)結(jié)構(gòu)要點(diǎn): ⑴蛋白質(zhì)中的肽鍵都是由 αNH2和 αCOOH 結(jié)合生成的。 ⑵每一種蛋白質(zhì)都有相同的肽主鏈結(jié)構(gòu),各種蛋白質(zhì)間的差異是蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)量及排列順序不同。 ⑶氨基酸的 α NH2和 α COOH 縮合,只有末端及側(cè)鏈基團(tuán)有化學(xué)活性。 ⑷每個(gè)蛋白質(zhì)或每個(gè)蛋白質(zhì)的亞基只有一個(gè) α NH2 和 α COOH ⑸分子量大于 5000 的活性肽才能稱為蛋白質(zhì)。 三、 .蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 推斷 預(yù)測(cè) 氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu)) → 空間結(jié)構(gòu) (高級(jí)結(jié)構(gòu)) → 功能 (一) 蛋白質(zhì)測(cè)序的一般步驟 祥見 P116 ( 1) 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 ( 2) 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。 ( 3) 測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。 ( 4) 斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。 ( 5) 分析多肽鏈的 N 末端和 C 末端。 ( 6) 多肽鏈部分裂解成肽 段。 ( 7) 測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序 ( 8) 確定肽段在多肽鏈中的順序。 ( 9) 確定多肽鏈中二硫鍵的位置。 (二) 蛋白質(zhì)測(cè)序的基本策略 對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì),理想方法是從 N 端直接測(cè)至 C 端,但目前只能測(cè) 60 個(gè) N 端氨基酸。 29 直接法(測(cè)蛋白質(zhì)的序列) 兩種以上特異性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用兩種不同的裂解方法,產(chǎn)生兩 組切點(diǎn)不同的肽段,分離純化每一個(gè)肽段,分離測(cè)定兩個(gè)肽段的氨基酸序列,拼接成一條完整的肽鏈。 間接法(測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列) 核酸測(cè)序,一次可測(cè) 600800bp (三) 測(cè)序前的準(zhǔn)備工作 蛋白質(zhì)的純度鑒定 純度要求, 97%以上,且均一,純度鑒定方法。(兩種以上才可靠) ⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)要求一條帶 ⑵ DNS— cl(二甲氨基萘磺酰氯)法測(cè) N 端氨基酸 測(cè)定分子量 用于估算氨基酸殘基 n= 方法:凝膠過濾法、沉降系數(shù)法 確定亞基種類及數(shù)目 多亞基蛋白的亞基間有兩種結(jié)合方式: ⑴非共價(jià) 鍵結(jié)合 8mol/L 尿素, SDS SDSPAGE 測(cè)分子量 ⑵二硫鍵結(jié)合 過甲酸氧化: — S— S— +HCOOOH → SO3H β巰基乙醇還原: 舉例 :: 血紅蛋白 (α 2β 2) (注意,人的血紅蛋白 α 和β的 N 端相同。) 分子量: M 拆亞基: M1 、 M2 兩條帶 拆二硫鍵: M1 、 M2 兩條帶 110mw 30 分子量關(guān) 系: M = 2M1 + 2M2 測(cè)定氨基酸組成 主要是酸水解,同時(shí)輔以堿水解。氨基酸分析儀自動(dòng)進(jìn)行。 確定肽鏈中各種 出現(xiàn)的頻率 ,便于選擇裂解方法及試劑。 ① Trp 測(cè)定 對(duì)二甲基氨基苯甲醛 590nm。 ② Cys 測(cè)定 5/一二硫代雙( — 2— 硝基苯甲酸) DTNB , 412nm 端基分析 ① N 端分析 DNScl 法:最常用,黃色熒光,靈敏度極高, DNS多肽水解后的 DNS氨基酸不需要提取。 DNFB 法: Sanger 試劑, DNP多肽,酸水解,黃色 DNP氨基酸,有機(jī)溶劑( 乙酸乙酯)抽提分離,紙層析、薄層層析、液相等 PITC 法: Edman 法,逐步切下。無色 PTH氨基酸,有機(jī)溶劑抽提,層析。 ② C 端分析 A.肼解法 H2NABCDCOOH 無水肼 NH2NH2 100℃ 510h。 ANHNH2 、 BNHNH2 、 CNHNH2 、 DCOOH 氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀, C 端在上清中, Gln、 Asn、 Cys、 Arg 不能用 此法。 B.羧肽酶法( Pro 不能測(cè)) 羧肽酶 A:除 Pro、 Arg、 Lys 外的所有 C 端 羧肽酶 B:只水解 Arg、 Lys N H2N? ? ? ? ? Val— Ser— Gly C 圖 P118 羧肽酶法測(cè) C 末端 (四) 肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化 化學(xué)裂解法 ①溴化氰 — Met— X— 產(chǎn)率 85% ②亞碘?;郊姿? — Trp— X— 產(chǎn)率 70100% ③ NTCB( 2硝基 5硫氰苯甲酸) — X— Cys— ④羥胺 NH2OH — Asn— Gly— 約 150 個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次 31 酶法裂解 ①胰蛋白酶 Lys X (X ≠ Pro) Arg—— X ②胰凝乳蛋白酶 Tyr—— X (X ≠ Pro) Trp—— X Phe—— X 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)—— Phe(Trp、 Try、 Leu) ③ Glu 蛋白酶 Glu—— X ( V8蛋白酶) ④ Arg 蛋白酶 Arg—— X ⑤ Lys 蛋白酶 X—— Lys ⑥ Pro 蛋白酶 Pro—— X 肽段的分離純化 ①電泳法 SDS-PAGE 根據(jù)分子量大小分離 ②離子交換層析法( DEAE— Cellulose、 DEAE— Sephadex) 根據(jù)肽 段的電荷特性分離 ③反相HPLC法 根據(jù)肽段的極性分離 ④凝膠過濾 肽段純度鑒定 分離得到的每一個(gè)肽段,需分別鑒定純度,常用DNS- c l 法 要求:SDS-PAGE單帶、HPLC單峰、N端單一。 (五) 肽段的序列測(cè)定及肽鏈的拼接 Edman 法 一次水解一個(gè)N端 32 ( 1)耦聯(lián) PITC + H2 N— ABCD?? pH8— 9 , 40℃ PTC—— ABCD?? ( 2)裂解 PTC— ABCD?? TFA 無水三氟乙酸 ATZ— A + H2N— BCD ( 3)轉(zhuǎn)化 ATZ— A PTH— A 用 GC 或 HPLC 測(cè)定 PTHA PTC 肽:苯氨基硫甲酰肽 ATZ:噻唑啉酮苯胺(一氨基酸) PTH:苯乙內(nèi)酰硫脲(一氨基酸) 耦聯(lián):得 PTC 肽 一次循環(huán) 裂解: ATZ 轉(zhuǎn)化: 反應(yīng)產(chǎn)率 99% 循環(huán)次數(shù) 120 (偶聯(lián)、降 98% 60 解兩步) 90% 40 DNSEdman 法 用 DNS 法測(cè) N 末端,用 Edman 法提供( n1)肽段。 A-B-C-D-E肽 圖 有色 Edman 法 熒光基團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的 PITC 試劑。 用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序 儀器原理: Edman 法,可測(cè) 60 肽。 1967 液相測(cè)序儀 自旋反應(yīng)器,適于大肽段。 1971 固相測(cè)序儀 表面接有丙氨基的微孔玻璃球,可耦連肽段的C端。 1981 氣相測(cè)序儀 用 Polybrene 反應(yīng)器。 (聚陽離子)四級(jí)銨鹽聚合物 液相: 5nmol 2040 肽 97% 氣相: 5pmol 60 肽 98% 肽段拼接成肽鏈 16 肽,N端 H C端S 33 A法裂解: ONS PS EOVE RLA HOWT B 法裂解: SEO WTON VERL APS HO 重疊法確定序列: HOWTONSEOVER LAPS (六) 二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定 二硫鍵的確定(雙向電泳法) 碘乙酰胺封閉 SH 胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì) 第一向電泳 過甲酸氧化 — S— S— 生成 SO3H 第二向電泳 分離出含二硫鍵的兩條短肽,測(cè)序 與拼接出的肽鏈比較,定出二硫鍵的位置。 酰胺的確定 Asp –Asn、 GluGln 酶解肽鏈,產(chǎn)生含單個(gè) Asx 或 Glx 的肽,用電泳法確定是 Asp 還是 Asn 舉例: LeuGlxProVal 肽在 pH= 時(shí),電荷量是 Leu+ Pro0 Va l 此肽除 Glx 外,凈電荷為 0,可根據(jù)此肽的電泳行為確定是 Glu 或是 Gln。 糖、脂、磷酸基位置的確定 糖類通過 Asn、 Ser 與蛋白質(zhì)連接, N糖苷 0糖苷 脂類: Ser、 Thr、 Cys 磷酸: Ser、 Thr、 His 經(jīng)驗(yàn)性序列: Lys(Arg)SerAsnSer(PO4) ArgThrLeuSer(PO4) Lys(Arg) –AlaSer(PO4) 四、 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能 (一) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)舉例: ( 1) 牛胰島素 Sanger 于 1953 年首次完成測(cè)序工作。 P128 圖 338 分子量: 5700 dalton 51 個(gè) 殘基, A 鏈 21 個(gè)殘基, B 鏈 30 個(gè)殘基, A 鏈內(nèi)有一個(gè)二硫鍵 Cys 6—Cys 11 34 鏈間有二個(gè)二硫鍵 7 — B Cys 7 20—B Cys 19 ( 2)核糖核酸酶( RNase) P128 圖 339 分子量: 12600 124 個(gè) 殘基 4 個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。 牛胰 RNase 變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn): P164 圖 369。 (8M 尿素 +β硫基乙醇 )變性、失活→透析,透析后構(gòu)象恢復(fù), 活性恢復(fù) 95%以上,而二硫鍵正確復(fù)性的概率是 1/105。 ( 3)人血紅蛋白α和β鏈及肌紅蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu) P129 圖 340 (二) 同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化 同源蛋白質(zhì): 在不同的生物體內(nèi)具有同一功能的蛋白質(zhì)。如:血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能,細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。 同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn): ①多肽鏈長度相同或相近 ②同源蛋白質(zhì)的 氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的,稱不變殘基,不變殘基高度保守,是必需的。 ③除不變殘基以外,其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化,稱可變殘基,可變殘基中,個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。 通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化,親源關(guān)系越遠(yuǎn),同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。 細(xì)胞色素 C 存在于線粒體膜內(nèi),在真核細(xì)胞的生物氧
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