【正文】 ③除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。 (8M 尿素 +β硫基乙醇 )變性、失活→透析，透析后構(gòu)象恢復(fù)， 活性恢復(fù) 95%以上，而二硫鍵正確復(fù)性的概率是 1/105。 酰胺的確定 Asp –Asn、 GluGln 酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè) Asx 或 Glx 的肽，用電泳法確定是 Asp 還是 Asn 舉例： LeuGlxProVal 肽在 pH= 時(shí)，電荷量是 Leu+ Pro0 Va l 此肽除 Glx 外，凈電荷為 0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是 Glu 或是 Gln。 1967 液相測序儀 自旋反應(yīng)器，適于大肽段。 B．羧肽酶法（ Pro 不能測） 羧肽酶 A：除 Pro、 Arg、 Lys 外的所有 C 端 羧肽酶 B：只水解 Arg、 Lys N H2N? ? ? ? ? Val— Ser— Gly C 圖 P118 羧肽酶法測 C 末端 （四） 肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化 化學(xué)裂解法 ①溴化氰 — Met— X— 產(chǎn)率 85% ②亞碘酰基苯甲酸 — Trp— X— 產(chǎn)率 70100% ③ NTCB（ 2硝基 5硫氰苯甲酸） — X— Cys— ④羥胺 NH2OH — Asn— Gly— 約 150 個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次 ３１ 酶法裂解 ①胰蛋白酶 Lys X (X ≠ Pro) Arg—— X ②胰凝乳蛋白酶 Tyr—— X (X ≠ Pro) Trp—— X Phe—— X 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)—— Phe(Trp、 Try、 Leu) ③ Glu 蛋白酶 Glu—— X （ V8蛋白酶） ④ Arg 蛋白酶 Arg—— X ⑤ Lys 蛋白酶 X—— Lys ⑥ Pro 蛋白酶 Pro—— X 肽段的分離純化 ①電泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 根據(jù)分子量大小分離 ②離子交換層析法（ DEAE— Cellulose、 DEAE— Sephadex） 根據(jù)肽 段的電荷特性分離 ③反相ＨＰＬＣ法 根據(jù)肽段的極性分離 ④凝膠過濾 肽段純度鑒定 分離得到的每一個(gè)肽段，需分別鑒定純度，常用ＤＮＳ－ c l 法 要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ單帶、ＨＰＬＣ單峰、Ｎ端單一。 DNFB 法： Sanger 試劑， DNP多肽，酸水解，黃色 DNP氨基酸，有機(jī)溶劑（ 乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等 PITC 法： Edman 法，逐步切下。氨基酸分析儀自動(dòng)進(jìn)行。 ２９ 直接法（測蛋白質(zhì)的序列） 兩種以上特異性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用兩種不同的裂解方法，產(chǎn)生兩 組切點(diǎn)不同的肽段，分離純化每一個(gè)肽段，分離測定兩個(gè)肽段的氨基酸序列，拼接成一條完整的肽鏈。 （ 6） 多肽鏈部分裂解成肽 段。 （ 2） 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。 ⑵每一種蛋白質(zhì)都有相同的肽主鏈結(jié)構(gòu)，各種蛋白質(zhì)間的差異是蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)量及排列順序不同。 單鏈蛋白質(zhì)只有一、二、三級結(jié)構(gòu)，無四級結(jié)構(gòu)。 結(jié)構(gòu)域： 大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此分開，以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的獨(dú)立折疊單位，一般由 100200 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。 《神經(jīng)生物化學(xué)》 神經(jīng)多肽 生物體內(nèi)多肽或寡肽的來源： ①合成蛋白質(zhì)的剪切、修飾 ②酶專一性逐步合成（如谷胱甘肽）、 ③動(dòng)物腸道可吸收寡肽 第十一節(jié) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（共價(jià)結(jié)構(gòu)） 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)也稱共價(jià)結(jié)構(gòu)、主鏈結(jié)構(gòu)。 2GSH GS— SG H2O2 + 2GSH 2H2O + GS— SG 短桿菌肽（抗生素） 由短桿菌產(chǎn)生的 10 肽環(huán)。 生物的生長、發(fā)育、細(xì)胞分化、大腦功能、免疫、生殖、衰老、病變等都涉及到活性肽。 肽的化學(xué)反應(yīng) 和游離氨基酸一樣，肽的 α— 羧 基， α— 氨基和側(cè)鏈 R 基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。 圖 將Ｒ ＋＋ — 變成Ｒ ＋ — ，就必須考慮 R＋ — 與 R（ + ， + ， 1）等同，即側(cè)鏈 — N+H3解離 50%，此時(shí) 圖 LysLysLys 分子中有三個(gè)側(cè)鏈可解離，它的 R+實(shí)際相對于 R（ + ， + ， + ， 1 ），此時(shí)每個(gè)側(cè)鏈解離后帶有 1/3 個(gè)正電荷。 在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。 （ 4）肽鏈中的肽鍵一般是反式構(gòu)型，而 Pro 的肽鍵可能出現(xiàn)順、反兩種構(gòu)型． ２５ 圖 二、 肽的重要性質(zhì) 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。 圖 P111 下 肽鍵結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)１中，Ｃ－Ｎ單鍵長 結(jié)構(gòu)２中，Ｃ＝Ｎ雙鍵長０ .127nm 結(jié)構(gòu)３中，Ｃ Ｎ鍵長 ，６個(gè)原子幾 乎處在同一平面內(nèi) （酰氨平面） 。 由兩個(gè)氨基酸形成的肽叫二肽， 少于 10 個(gè)氨基酸的肽叫寡肽， 多于 10 個(gè)氨基酸的肽叫多肽。 （四） 側(cè)鏈 R基參加的反應(yīng) —— 用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾 （不作要求，只提一下，《陶慰孫》第四章） 七、 氨基酸的分離和分析 電泳分離 電泳的基本原理 舉例： Glu、 Leu 、 His 、 Lys， 4 種混合樣，在 時(shí)，泳動(dòng)方向及相對速度。 圖 S腺嘌呤核苷 高半胱氨酸（比 Cys 多一個(gè) CH2） ２３ （二） α羧基參加的反應(yīng) ①成鹽、成酯 分別與堿、醇作用 ②成酰氯的反應(yīng)（使羧基活化） 氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰氯。 圖 西佛堿是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物）。 第一次大戰(zhàn)中使用的芥子氣，它的主要作用是使氨基酸的α 氨基烷基化，從而破壞蛋白質(zhì)的正常功能。 將經(jīng)過勻漿的動(dòng)物肝臟組織與 Gly、苯甲酸和 ATP 混合保溫，從混合液中可分離出 N苯甲酸一 Gly。 ②丹磺酰氯（ DNScl， 5— 二甲基氨基萘 1磺酰氯） DNS— cl 可用于多肽鏈 — NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測定。 在生理?xiàng)l件下，只有 His 有緩沖能力。 和 Glu能作為緩沖液使用的 pH 范圍 ①解：見圖 ② Glu和 Glu=各 50%時(shí) pH 為 ③ pH 時(shí) Glu 總帶正電荷 ④ Glu177。 以 Gly 為例 pH 正 + — + pH= 正 + pH 正 — 0 pH 負(fù) 0 — pH 負(fù) — 問題： （ 1） pH = pKa/ 時(shí)，緩沖能力最大，等電點(diǎn)時(shí)緩沖能力最小。 第三拐點(diǎn)： pH=pK2+lg[Gly]/[Gly177。 凈電荷： 0 等電點(diǎn) pI 第三拐點(diǎn)： 50%Gly177。 圖 氨基酸的兩性解離和酸堿滴定曲線 HA A + H+ pH=pKa/ +Log[共軛堿 ]／ [共軛酸 ] pOH=pKb/+Log[共軛酸 ]／ [共軛堿 ] （ 1） pH pKa/ 時(shí)， [堿 ] [酸 ] pH = pKa/ 時(shí)， [堿 ] = [酸 ] pH pKa/ 時(shí)， [酸 ] [堿 ] （ 2） pKa/ 就是 [堿 ] = [酸 ]時(shí)溶液的 pH 值， Ka/就是此時(shí)溶液的 [H+] （ 3）當(dāng) [堿 ] = [酸 ]時(shí)，溶液的 pH 值等于 pKa/ （ 4） Gly 的兩性解離和滴定曲線 圖 314 Gly 的滴定曲線 在 和 處， Gly 具有緩沖能力。 原因：α 羧基 pK1 在 左右，當(dāng) pH，α 羧基以 COO形式存在。 103 LambertBeer： 五、 氨基酸的酸堿性質(zhì)（重點(diǎn)） 氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在 α 氨 基酸都含有 COOH 和 NH2，都是不揮發(fā)的結(jié)晶固體，熔點(diǎn) 200350℃，不溶于非極性溶??????? LcTIIIA .lglg 0 ? １９ 劑，而易溶于水，這些性質(zhì)與典型的羧酸（ RCOOH）或胺（ RNH2）明顯不同。 Tyr、 Phe、 Trp 的 R 基含有共軛雙鍵，在 220300nm 紫外區(qū)有吸收。 內(nèi)消旋物： 分子內(nèi)消旋 胱氨酸有三種立體異構(gòu)體： L胱氨酸、 D胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。 外消旋物： D型和 L型的等摩爾混合物。其余 17 種氨基酸的 L 型 與 D型互為鏡象關(guān)系，互稱光學(xué)異構(gòu)體（對映體，或立體異構(gòu)體）。 四、 氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收 氨基酸的構(gòu)型 除 Gly 外， 19 種氨基酸的α 碳原子都是不對稱碳原子，因此有兩種光學(xué)異構(gòu)體，而 Thr 和Ile 的β 碳原子也是不對稱的，因此 Thr、 Ile 各有兩個(gè)不對稱碳原子，有四種光學(xué)異構(gòu)體。 （ 3） 6N甲基賴氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)г 羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合 Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。 （二） 非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸 也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成 后，由基本氨基酸修飾而來。 當(dāng)膠原蛋白中的 Lys 側(cè)鏈氧化時(shí)能形成很強(qiáng)的分子間 (內(nèi) )交聯(lián)。 酪氨酸的 OH 磷酸化是一個(gè)十分普遍的調(diào)控機(jī)制， Ser 和 Thr 的 OH 往往與糖鏈相連， Asn和 Gln 的 NH2很容易形成氫鍵，因此能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。它在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中具有極重要的作用，一般出現(xiàn)在兩段 α螺旋之間的轉(zhuǎn)角處， Pro 殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化， ? 必需氨基酸 ： 成年人： Leu、 Ile、 Val、 Thr、 Met、 Trp、 Lys、 Phe 嬰兒期： Arg 和 His 供給不足，屬半必須氨基酸。 酪氨酸的 OH 磷酸化是一個(gè)十分普遍的調(diào)控機(jī)制， Tyr 在較高 pH 值時(shí)，酚羥基離解。 （ 14）、 R 中含有芳基的氨基酸（ 3種） Phe、 Try、 Trp 圖 38 都具有共軛 π 電子體系 , 易與其它缺電子體系或 π 電子體系形成電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物( chargetransfer plex)或電子重疊復(fù)合物。（如肽聚糖的短肽間的連接） Arg 是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿， pKa 值為 ，生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。 大量服用青霉胺 (Penicillcemine)能降低腎中胱氨的含量，因?yàn)榍嗝拱放c半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。 Met 的 R 中含有甲硫基（ SCH3），硫原子有親核性，易發(fā)生極化，因此， Met 是一種重要的甲基供體。 含硫的兩種： Cys、 Met 圖 34 Cys 中 R 含巰基（ SH）， Cys 具有兩個(gè)重要性質(zhì)： （ 1）在較高 pH 值條件，巰基離解。 圖 33 Ser 的 CH2 OH 基（ pKa=15），在生理?xiàng)l件下不解離，但它是一個(gè)極性基團(tuán)，能與其它基團(tuán)形成氫鍵，具有重要的生理意義。 ） P 92 表 37 （比較等電點(diǎn)。 α 氨基酸都是白色晶體，熔點(diǎn)一般在 200℃以上。 （一） 編碼的蛋白質(zhì)氨基酸（ 20種） 也稱基本氨基酸或標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，有對應(yīng)的遺傳密碼。 （ 8）、 氨基酸是許多含 N分子的前體物 核苷酸和核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要 aa （ 9）、 一些基本氨基酸和非基本 aa是代謝中間物 精氨酸、 Citru