【正文】 通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化，親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。 同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)： ①多肽鏈長度相同或相近 ②同源蛋白質(zhì)的 氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。 （ 3）人血紅蛋白α和β鏈及肌紅蛋白的一級結(jié)構(gòu) P129 圖 340 （二） 同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化 同源蛋白質(zhì)： 在不同的生物體內(nèi)具有同一功能的蛋白質(zhì)。 牛胰 RNase 變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)： P164 圖 369。 糖、脂、磷酸基位置的確定 糖類通過 Asn、 Ser 與蛋白質(zhì)連接， N糖苷 0糖苷 脂類： Ser、 Thr、 Cys 磷酸： Ser、 Thr、 His 經(jīng)驗(yàn)性序列： Lys(Arg)SerAsnSer(PO4) ArgThrLeuSer(PO4) Lys(Arg) –AlaSer(PO4) 四、 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與生物功能 （一） 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)和功能 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)舉例： （ 1） 牛胰島素 Sanger 于 1953 年首次完成測序工作。 （聚陽離子）四級銨鹽聚合物 液相： 5nmol 2040 肽 97% 氣相： 5pmol 60 肽 98% 肽段拼接成肽鏈 16 肽，Ｎ端 H Ｃ端Ｓ ３３ Ａ法裂解： ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ 法裂解： SEO WTON VERL APS HO 重疊法確定序列： HOWTONSEOVER LAPS （六） 二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定 二硫鍵的確定（雙向電泳法） 碘乙酰胺封閉 SH 胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì) 第一向電泳 過甲酸氧化 — S— S— 生成 SO3H 第二向電泳 分離出含二硫鍵的兩條短肽，測序 與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。 1971 固相測序儀 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。 用自動序列分析儀測序 儀器原理： Edman 法，可測 60 肽。 （五） 肽段的序列測定及肽鏈的拼接 Edman 法 一次水解一個(gè)Ｎ端 ３２ （ 1）耦聯(lián) PITC ＋ H２ N— ABCD?? pH8— 9 ， 40℃ PTC—— ABCD?? （ 2）裂解 PTC— ABCD?? TFA 無水三氟乙酸 ATZ— A + H2N— BCD （ 3）轉(zhuǎn)化 ATZ— A PTH— A 用 GC 或 HPLC 測定 PTHA PTC 肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸） 耦聯(lián)：得 PTC 肽 一次循環(huán) 裂解： ATZ 轉(zhuǎn)化： 反應(yīng)產(chǎn)率 99％ 循環(huán)次數(shù) 120 (偶聯(lián)、降 98% 60 解兩步） 90% 40 DNSEdman 法 用 DNS 法測 N 末端，用 Edman 法提供（ n1）肽段。 ANHNH2 、 BNHNH2 、 CNHNH2 、 DCOOH 氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀， C 端在上清中， Gln、 Asn、 Cys、 Arg 不能用 此法。無色 PTH氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析。 ② Cys 測定 5/一二硫代雙（ — 2— 硝基苯甲酸） DTNB ， 412nm 端基分析 ① N 端分析 DNScl 法：最常用，黃色熒光，靈敏度極高， DNS多肽水解后的 DNS氨基酸不需要提取。 確定肽鏈中各種 出現(xiàn)的頻率 ,便于選擇裂解方法及試劑。） 分子量： M 拆亞基： M1 、 M2 兩條帶 拆二硫鍵： M1 、 M2 兩條帶 110mw ３０ 分子量關(guān) 系： M = 2M1 + 2M2 測定氨基酸組成 主要是酸水解，同時(shí)輔以堿水解。 間接法（測核酸序列推斷氨基酸序列） 核酸測序，一次可測 600800bp （三） 測序前的準(zhǔn)備工作 蛋白質(zhì)的純度鑒定 純度要求， 97%以上，且均一，純度鑒定方法。 （二） 蛋白質(zhì)測序的基本策略 對于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從 N 端直接測至 C 端，但目前只能測 60 個(gè) N 端氨基酸。 （ 7） 測定各個(gè)肽段的氨基酸順序 （ 8） 確定肽段在多肽鏈中的順序。 （ 5） 分析多肽鏈的 N 末端和 C 末端。 （ 3） 測定多肽鏈的氨基酸組成。 三、 ．蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定 推斷 預(yù)測 氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)） → 空間結(jié)構(gòu) （高級結(jié)構(gòu)） → 功能 （一） 蛋白質(zhì)測序的一般步驟 祥見 P116 （ 1） 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 ⑶氨基酸的 α NH2和 α COOH 縮合，只有末端及側(cè)鏈基團(tuán)有化學(xué)活性。 一級結(jié)構(gòu)要點(diǎn)： ⑴蛋白質(zhì)中的肽鍵都是由 αNH2和 αCOOH 結(jié)合生成的。 RNase 單 條肽鏈 肌紅蛋白 單體蛋白 胰島素 ２８ 多條肽鏈 胰凝乳蛋白酶 蛋白質(zhì) 相同亞基 一種乳酸脫氫酶 α 4 寡聚蛋白 不同亞基 血紅蛋白 α 2β 2 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) (序列 )中含有形成高級結(jié)構(gòu)的全部需的信息，一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)及功能。 四級結(jié)構(gòu)： 寡聚蛋白中亞基種類、數(shù)目、空間排布及亞基間相互作用力。 三級結(jié)構(gòu)： 多肽鏈通過盤旋、折疊，形成緊密的借各種次級鍵維持的球狀構(gòu)象。 超二級結(jié)構(gòu)： 由兩個(gè)以上二級結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)的組合體如 αα 、β α β、βββ。 一、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層 次 一級結(jié)構(gòu)（氨基酸順序、共價(jià)結(jié)構(gòu)、主鏈結(jié)構(gòu)） ↓ 是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序 二級結(jié)構(gòu) ↓ 超二級結(jié)構(gòu) ↓ 構(gòu)象（高級結(jié)構(gòu)） 結(jié)構(gòu)域 ↓ 三級結(jié)構(gòu) (球狀結(jié)構(gòu) ) ↓ 四級結(jié)構(gòu) (多亞基聚集體 ) 一級結(jié)構(gòu)： 共價(jià)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序 (含二硫鍵 ) 二級結(jié)構(gòu)： 多肽鏈主鏈中各個(gè)肽段形成的規(guī)則的或無規(guī)則的構(gòu)象。 1982 年，中科院上海生化所用蛋白質(zhì)工程技術(shù)合成了 Leu腦啡肽，既有鎮(zhèn)痛作用又不會象嗎啡那樣使人上癮?？垢锾m氏陽性細(xì)菌，臨床用于治療化濃性病癥。 谷胱甘肽 Glu— Cys— Gly 廣泛存在于動 、植、微生物細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)參與氧化還原過程，清除內(nèi)源性過氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。 活性肽是細(xì)胞內(nèi)部、細(xì)胞間、器官間信息溝通的主要化學(xué)信使。 圖 三、 天然存在的活性肽 生物體內(nèi)存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很強(qiáng)的生物活性，稱活性肽。 凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且可用于定量分析。可將肽鏈內(nèi)酸性殘基和堿性殘基進(jìn)行清點(diǎn)比較，推測等電點(diǎn)偏酸還是偏堿，然后用等電點(diǎn)聚焦電泳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定。 21 213131 31 ２６ 問題 2： 把一個(gè)氨基酸結(jié)晶加入 的純水中，得到 的溶液，此氨基酸的 pI 值是大于 ？ 小 于 ? 還是等于 ？ （小于 ） 多肽的等電點(diǎn)，隨著肽鏈內(nèi)酸性氨基酸殘基數(shù)的增加而下降，隨著肽鏈內(nèi)堿性氨基酸殘基數(shù)的增加而上升。 問題 1： 求出二肽 Lys—Lys 及三肽 Lys—Lys—Lys 的 pI 值。 肽中的末端 α－ COOH pK 值比游離 中的大一些，而末端 α－Ｎ ＋ Ｈ ３ 的 pK 值比游離氨基酸中的小一些， R 基變化不大。 在 pH0― 14 范圍內(nèi)， 肽鍵中的亞氨基不解離，因此肽的酸堿性質(zhì)主要取決于Ｎ端 α－ＮＨ ２和Ｃ端 α－ COOH 以及側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。蛋白質(zhì)水解得到的各種短肽，只要不發(fā)生消旋作用，也具有旋光性。 （ 3）肽鍵亞氨基在 pH014 內(nèi)不解離。 肽鍵結(jié)構(gòu)介于１和２之間（結(jié)構(gòu) 3），是結(jié)構(gòu) 1 和結(jié)構(gòu) 2 之間的平均中間狀態(tài)。 （ 2）肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)，具有平面性。 結(jié)構(gòu)： P111 上 5 肽 主要重復(fù)單位： 側(cè)鏈Ｒ：由不同的氨基酸殘 基構(gòu)成 名稱：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 寫法： Ｎ SerGlyTryAlaLeu 或ＳＧＹＡＬ，如果倒過來寫，則表示不同的肽，如Leu—AlaTyrGlySer。 肽鍵： 氨基酸間脫水后形成的共價(jià)鍵稱肽鍵（酰氨鍵），其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。 Glu Leu His Lys pI 圖 ??? ???? rG qR ２４ 濾紙層析和薄層層析 分配原理 離子交換層析分離氨基酸 磺酸型陽離子交換樹脂 圖 樹脂先用含 Na 的緩沖液處理成鈉鹽，且 pH 在 2 左右，將氨基酸混合液（ pH23） 上柱，氨基酸此時(shí)是陽離子，與樹脂上的鈉離子交換，被固定在樹脂上。（ λmax=570nm） 圖 定性、定量。 圖 此反應(yīng)使氨基酸的羧基活化，易與另一個(gè)氨基酸的氨基結(jié)合，在多肽的人工合成中常用。 圖 在酶催化下， SAM 可以使多種生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰膽堿的生物合成。 ⑥含硫氨基酸的烷基化反應(yīng) 硫原子也是親核中心，可發(fā)生親核取代反應(yīng)。被 Edman 用來鑒定多肽的 NH2末端氨基酸 ⑤生成西佛堿的反應(yīng)（ Schiff） 氨基酸的α氨基與醛類反應(yīng)，生成西佛堿。 圖 ③ Sanger 反應(yīng)（ 一二硝基氟苯， DNFP） 圖 二硝基苯基氨基酸（ DNP氨基酸），黃色，層析法鑒定，被 Sanger 用來測定多肽的 NH2末端氨基酸。 ①肌氨酸是存在于生 物組織中重要的組分，它是 Gly 甲基化的產(chǎn)物： 圖 ②強(qiáng)親電的有機(jī)物能與α NH2發(fā)生烷基化反應(yīng)。 圖 苯甲酸是食品防腐劑，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成 N苯甲酰 Gly 后，可經(jīng)尿排出。 苯甲酸與 Gly 的氨基的?；磻?yīng)是生物體內(nèi)解毒作用的一個(gè)典型的例子。 圖 N Gly— Ala— Ser— Leu— Phe C →→→→ DNS— Gly— Ala— Ser— Leu— Phe C 水解 DNS— Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe DNS氨基酸在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。這些酰化劑在多肽和蛋白質(zhì)的人工合成中被用作氨基保護(hù)劑。 血紅蛋白 中 His 含量高，在血液中具很強(qiáng)的緩沖能力。 圖 ②表中只有 His 的咪唑基側(cè)鏈在生理?xiàng)l件下不帶電荷。 和 Glu