【正文】 生物合成：方向 5’ 3’，需模板，引物，用酶。 圖 鏈的增長反應(yīng)是引物 DNA的 3’OH，對脫氧核糖核苷三磷酸的α 磷原子親核進(jìn)攻的結(jié)果。 （二） 雙脫氧終止法 英國 Sanger 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu) 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎 1980 設(shè)計出 DNA測序法 1980 再獲諾貝爾化學(xué)獎 合成一段與待測 DNA序列互 補(bǔ)的 DNA片段群。 六、 DNA 序列分析 （一） 化學(xué)裂解法（ MaxamGilbert 法） DNA一級結(jié)構(gòu)測定原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長度只差一個核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長度只差一個核苷酸 DNA片段的 PAGE 上分離。 mRNA易形成局部二級結(jié)構(gòu)，因此，總 RNA或 mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止 RNA形成二級結(jié)構(gòu)。 可用 DNA或 RNA探針。 例如 HindIII AAGCTT 四、 DNA 物理圖譜及構(gòu)建 （限制酶切圖譜、 DNA酶切位點圖譜） 在研究某一種 DNA 時，弄清該 DNA 分子有哪些限制酶切位點是很重要的。 BamHI： GGATCC 同裂酶： BstI GGATCC 同尾酶： BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC 星號活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性 pH，或 50%甘油），限制酶的特異性降低。 BamH： GGATCC 同裂酶 BstI 識別位點相同，切割位點相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 II 型酶的切割頻率 識別位點 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 Not I GCGGCCGC 限制酶的命名： 第一位： 屬名 E（大寫） 第二、三位： 種名的頭兩個字母小寫 co 第四位： 菌株 R 第五位： 羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號。 ④ 電流，不大于 5V/cm PAGE 電泳 三、 限制性核酸內(nèi)切酶（ 1979 年發(fā)現(xiàn)） 限制修飾系統(tǒng) 圖 II 型核酸內(nèi)切酶 核酸內(nèi)切酶有 I、 II、 III 三種類型，其中 II 型酶在 DNA克隆中十分有用。 去蛋白：鹽酸胍、苯酚等 必須防止 RNA酶對 RNA的 破壞。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。 DNA 分離純化 真核 DNA以核蛋白（ DNP）形式存在， DNP 溶于水或鹽（ 1mol/L），但不溶于 Nacl中，利用此性質(zhì)，可將 DNP 與 RNA核蛋白分開，提取出 DNP。 條件溫和，防止過酸、過堿。若這些異源 DNA 之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時會形成雜交分子。 對于 ， 106bp，濃度達(dá)到 umol/L 級時，濃度已很高。 A． 1 個核苷酸對（ ） 圖上查出 Cot1/2=4 若濃度為 Co= mol/L 則復(fù)性 50%所需時間 t= 秒 若要全部復(fù)性， Cot=104 t= 秒 B． 106 堿基對 圖上查出 Cot1/2=10 若濃度 Co= umol/L 則復(fù)性 50%所需時間 t=107 秒，約 115 天。 L1， t 為時間，以秒表示。 t 衡量。 DNA片段越大，復(fù)性越慢； DNA濃度越大，復(fù)性越快。 P351 圖 521 復(fù)性 變性 DNA在適當(dāng)（一般低于 Tm20— 25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 ② GC含量與 Tm值成正比， GC含量高，則 Tm越高，測定 Tm，可推知 GC 含量。 濃度 50ug/mL時，雙鏈 DNA A260=，完全變性（單鏈） A260= 當(dāng) A260 增加到最大增大值一半時，即 時，對應(yīng)的溫度即為 Tm。 （ 2）、 熔解溫度（ Tm）或稱熔點： DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度。 變性后 粘度降低，浮力密度升高。 DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。 變性 （ 1）、 變性： 核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。 P348 圖 5— 16 CsCl密度梯度離心純化質(zhì)粒 DNA 相對沉降常數(shù) 線型雙螺旋分子 松馳雙鏈閉環(huán) 切刻雙鏈環(huán) 單鏈環(huán) 線型單鏈 正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀 坍縮 五、 變性、復(fù)性及雜交 變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對蛋白質(zhì)來說，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。 含量計算 1 ABS 值相當(dāng)于： 50ug/mL 雙螺旋 DNA 或： 40ug/mL 單螺旋 DNA（或 RNA） 或： 20ug/mL 核苷酸 增色效應(yīng)與減色效應(yīng) P347 圖 515 DNA的紫外吸收光譜 增色效應(yīng)：在 DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大 減色效應(yīng)：在 DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。 純 RNA的 A260/A280 應(yīng)為 。 RNA是 DNA的信使，完成任務(wù)后降解。 DNA、 RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。 圖 在相同條件下， DNA不被水解。 DNA等電點 4— RNA 等電點 2— RNA 鏈中，核糖 C’2OH 的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成氫鏈，促進(jìn)磷酸酯羥基氫原子的解離。 大腸桿菌中有三類 rRNA（原核） 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 真核細(xì)胞有四類 rRNA 5S rRNA rRNA 18S rRNA 28S rRNA 圖 原核核糖體（ rRNA 部分） 圖 真核核糖體（ rRNA部分） P346 圖 514 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 一、 解離性質(zhì) 多聚核苷酸有兩類可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。 五、 rRNA 的結(jié)構(gòu) rRNA占總 RNA的 80%左右。 SD 序列和核糖體 16S 的 rRNA 的 3’末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)，這種互補(bǔ)序列與mRNA對核糖體的識別有關(guān)。 舉列： MS2病毒 mRNA， 3569 b，有三個順反子，分別編碼 A 蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶三種蛋白質(zhì)。 原核 mRNA（多順反子） 原核 mRNA由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻 譯區(qū)和末端序列組成。 P346 帽子結(jié)構(gòu) 帽子的功能： 可抵抗 5’核酸外切酶降解 mRNA。 PolyA大大提高 mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 polyA 與 mRNA 半壽期有關(guān)，新合成的 mRNA，其 polyA較長；而衰老的 mRNA，其 polyA較短。 PolyA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng) polyA聚合酶添加上， polyA聚合酶對 mRNA專一。 順反子：是由順反試驗所規(guī)定的遺傳單位，相當(dāng)于一種蛋白質(zhì)的基因。 四、 mRNA 的結(jié)構(gòu) mRNA是從 DNA上轉(zhuǎn)錄而來的，其功能是依據(jù) DNA的遺傳信息，指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的生物合成，每一種蛋白質(zhì)都由一種相應(yīng)的 mRNA編碼，細(xì)胞內(nèi) mRNA種類很多，大小不一，每種含量極低。 結(jié)構(gòu)特點 ①分子量在 25kd 左右， 7090b，沉降系數(shù) 4S 左右 ②堿基組成中有較多稀有堿基 圖 ③ 3’末端為? CpCpAOH，用來接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端。 如 23S rRNA