【正文】 純度 純 DNA的 A260/A280 應(yīng)為 （ ），若大于 ，表 示污染了 RNA。 （ 3）、 影響 DNA 的 Tm值的因素 ① DNA均一性 均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍 內(nèi)。 第五節(jié) 核酸研究技術(shù) 一、 核酸的分離純化 要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。結(jié)果，它的識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生變化。 化學(xué)合成：方向 3’ 5’，不需 DNA模板，不用酶。 同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。復(fù)性 100%Cot=500 t=5 108 秒， 5758 天。 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。這是因?yàn)?RNA中 C’2OH 的存在，促 進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。 （ 2）、 5’帽子帽子 5’末端的鳥嘌呤 N7 被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個(gè)核苷酸相連，形成5’5’磷酸二酯鍵。雙螺旋區(qū)一般占 RNA分子的 50%左右。 松馳環(huán)： L=25 解鏈環(huán)： L=23 超螺旋： L=23 ②纏繞數(shù)（ T） DNA分子中的 WatsonCrick 螺旋數(shù)目，以 T 表示 松馳環(huán) T=25 解鏈環(huán) T=23 超螺旋 T=25 ③超螺旋周數(shù)（扭曲數(shù) W） 松馳環(huán) W=0 解 鏈環(huán) W=0 超螺旋 W= 2 L=T+W ④比連環(huán)差（ λ） 表示 DNA的超螺旋程度 λ=（ L— L0） /L0 L0 是指松馳環(huán)形 DNA的 L 值 天然 DNA的超螺旋密度一般為 ~，平均每 100bp 上有 39 個(gè)負(fù)超螺旋。 （二） DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性 P339 表 56 A、 B、 ZDNA的比較 B— DNA：典型的 WatsonCrick 雙螺旋 DNA 右手雙股螺旋 每圈螺旋 個(gè)堿基對(duì) 每對(duì) 螺旋扭角 36176。堿基平面垂直于螺旋軸。 P334 圖 51 書 寫方法： 5/ → 3/： 5’pApCpTpG3’，或 5’? ACTG? 3’（在 DNA中， 3/OH 一般是游離的） 在 DNA 分子中，不變的骨架成分磷酸二酯鍵被逐漸省略，真正代表 DNA 生物學(xué)意義的是堿基的排列順序。 結(jié)構(gòu)層次： 核 酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 堿基 組成核酸的戊糖有兩種：： D核糖和 D2脫氧核糖，據(jù)此，可以將核酸分為兩種：核糖核酸（ RNA）和脫氧核糖核酸（ DNA） P330 表 51 兩類核酸的基本化學(xué)組成 一、 堿基 1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 鳥嘌呤 2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶 P331 結(jié)構(gòu)式 3. 修飾堿基 植物中有大量 5甲基胞嘧啶。 缺乏癥：肌肉出血、凝血時(shí)間延長。 第一節(jié) 脂溶性維生素 一、 維生素 A 和胡蘿卜素 P360 結(jié)構(gòu) 化學(xué)名稱：視黃醇，包括兩種： A A2 維生素 A的來源 β 胡蘿卜素、α 胡蘿卜素、γ 胡蘿卜素、黃玉米色素在肝臟、腸粘膜內(nèi)轉(zhuǎn)化成 A。 缺乏癥：佝僂癥等。 四、 維生素 B5 與煙酰胺輔酶 P369 維生素 B5 包括煙酸（尼克酸）、煙酰胺 （尼克酰胺） 煙酰胺是合成 NAD、 NADP 的前體 P369 結(jié)構(gòu)式：煙酸、煙酰胺、 NAD、 NADP NAD、 NADP 是各種脫氫酶的輔酶。 ③核苷 5’多磷酸 3’多磷酸化合物 ppGpp pppGpp ppApp ④核苷酸衍生物 HSCoA、 NAD+、 NADP+、 FAD 等輔助因子。 相對(duì)濕度 92%， DNA鈉鹽結(jié)晶， B— DNA。 較長的回文結(jié)構(gòu)，在某些因素作用下，可形成莖環(huán)式的十字結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 四、 環(huán)狀 DNA 生物體內(nèi)有些 DNA是以雙鏈環(huán)狀 DNA的形式存在，包括： 某些病毒 DNA 某些噬菌體 DNA 某些細(xì)菌染色體 DNA 細(xì)菌質(zhì)粒 DNA 真核細(xì)胞中的線粒體 DNA、葉綠體 DNA 環(huán)形 DNA 的不同構(gòu)象 P340 圖 58 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋 （ 1）、 松弛環(huán)形 DNA 線形 DNA直接環(huán)化 （ 2）、 解鏈環(huán)形 DNA 線形 DNA擰松后再環(huán)化 （ 3）、 正超螺旋與負(fù)超螺旋 DNA 線形 DNA擰緊或擰松后再環(huán)化，成為超螺旋結(jié)構(gòu)。 組蛋白是富含堿性 (Lys、 Arg)的堿性蛋白質(zhì)，根據(jù) Lys/Arg 比值不同，可分為 HH2A、 H2B、 H H4 五種，均為單鏈蛋白質(zhì)，分子量 1100021000。 順反子：是由順反試驗(yàn)所規(guī)定的遺傳單位，相當(dāng)于一種蛋白質(zhì)的基因。 五、 rRNA 的結(jié)構(gòu) rRNA占總 RNA的 80%左右。 P348 圖 5— 16 CsCl密度梯度離心純化質(zhì)粒 DNA 相對(duì)沉降常數(shù) 線型雙螺旋分子 松馳雙鏈閉環(huán) 切刻雙鏈環(huán) 單鏈環(huán) 線型單鏈 正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀 坍縮 五、 變性、復(fù)性及雜交 變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對(duì)蛋白質(zhì)來說，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。 DNA片段越大，復(fù)性越慢； DNA濃度越大，復(fù)性越快。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。 mRNA易形成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，總 RNA或 mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止 RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 六、 DNA 序列分析 （一） 化學(xué)裂解法（ MaxamGilbert 法） DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長度只差一個(gè)核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長度只差一個(gè)核苷酸 DNA片段的 PAGE 上分離。 去蛋白：鹽酸胍、苯酚等 必須防止 RNA酶對(duì) RNA的 破壞。 t 衡量。 變性 （ 1）、 變性： 核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。 大腸桿菌中有三類 rRNA（原核） 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 真核細(xì)胞有四類 rRNA 5S rRNA rRNA 18S rRNA 28S rRNA 圖 原核核糖體（ rRNA 部分） 圖 真核核糖體（ rRNA部分） P346 圖 514 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 一、 解離性質(zhì) 多聚核苷酸有兩類可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。 PolyA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng) polyA聚合酶添加上， polyA聚合酶對(duì) mRNA專一。 146bp 長度的 DNA雙螺旋盤繞在八聚體上形成核小體。 如果在繩子一端向松纏方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負(fù)超螺旋。 較短的回文序列，可作為一種特別信號(hào)，如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。 Z— DNA。 第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu) 一級(jí)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。 5’— 脫氧腺嘌呤核苷酸鈷胺素是 甲基丙二酸單酰輔酶 A變位酶的輔酶 九、 硫辛酸 丙酮酸脫羧酶復(fù)合體中的輔酶 （硫辛酰氨轉(zhuǎn)乙酰酶和二氫硫辛酰氨脫氫酶的輔酶） 十、