【正文】 圖 胰島素的基因工程： A鏈 63 個(gè)核苷酸 B 鏈 90 個(gè)核苷酸 （三） 序列分析儀 四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的 ddNTP 七、 DNA 合成（合成探針、引物、基因） 化學(xué)合成 —— DNA 合成儀 DNA固相合成（亞磷酸三酯法） 合成方向： 3’ 5’端 5’OH 用二對(duì)甲氧三苯甲基（ DMT）保護(hù)， 堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) 3’OH 用氨基磷酸化合物活化 P353 合成過(guò)程 保護(hù)： 5’OH、活化 3’OH、保護(hù) 所有 NH2 DNA 的酶合成 —— PCR 用 DNA聚合酶 I 必備條件： ①模板 DNA（單鏈） ②引物 ③ DNA聚合酶 ④ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP ⑤一定濃度的 Mg2+ 鏈合成方向： 5 ’ 3’端 新的 DNA鏈合成，從引物 DNA的 3’OH 開(kāi)始。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此 DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建 DNA物理圖譜： （ 1）單酶完全降解和部分降解 （ 2）雙酶降解 圖 五、 分子雜交 Southern Blotting P353 圖 523 DNA 樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影 變性（ NaOH ） 轉(zhuǎn)膜（ NC 膜） 固定（ 80℃， 46h） 雜交（高鹽濃度， 68℃，幾小時(shí)） Southern Blotting可用于 DNA之間同源性分析，確定特異性 DNA序列的大小和定位。 II 型酶的特點(diǎn)：限制和修飾活性分開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子 Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（反向重復(fù)）。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。 P352 圖 522，不同 DNA的復(fù)性時(shí)間。 GC%=（ ） P351 圖 519 圖 520 Tm值與 GC 含量的關(guān)系 ③介質(zhì)中離子強(qiáng)度 其它條件不變，離子強(qiáng)度高， Tm 高。 P350 圖 518 變性過(guò)程 熱變性 因素 酸堿變性（ pH 小于 4 或大于 11，堿基間氫鍵全部斷裂） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 260nm 吸收值升高。 若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則 A260/A280 比值明顯降低。 二、 水解性質(zhì) 堿水解 室溫， ，得到 2’或 3’磷酸核苷的混合物。 圖 MS2 病 mRNA 5’端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為 5’AGGAGGU3’，位于起始密碼子 AUG 前約 10 核苷酸處，此序列由 Shine 和 Dalgarno 發(fā)現(xiàn)，稱 SD 序列。 polyA功能： PolyA是 mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。 ④ 5’末端大多為 pG?或 pC? ⑤二級(jí)結(jié)構(gòu)是三葉草形 P345 圖 512 tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三葉草模型） 1966 年 Crick 對(duì)于 tRNA能識(shí)別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對(duì)的“擺動(dòng)學(xué)說(shuō)”： 認(rèn)為除 AU、 GC 配對(duì)外，還有非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)， IA、 IC、 IU，并強(qiáng)調(diào)密碼子的 5’端第 2 個(gè)堿基嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，而第 3 個(gè)堿基可以非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，具有一定程度的擺動(dòng)靈活性。 P343 圖 510 RNA基本結(jié)構(gòu) ① 組成 RNA的戊糖是核糖 ② 堿基中 RNA的 U 替代 DNA中的 T，此外， RNA中還有一些稀有堿基。 大腸桿菌 DNA結(jié)合蛋白： 每個(gè)細(xì)胞 H 兩個(gè) 28KD 的相同亞基 30000 個(gè)二聚體 HU 兩個(gè)各 9KD 的 不同亞基 40000 個(gè)二體聚體 HLP1 17KD 的亞基 20200 個(gè)單體 P 3KD 的亞基 未知 這些 DNA結(jié)合蛋白，使 106bp 的 DNA壓縮成為一個(gè)手腳架形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中心是多種 DNA結(jié)合蛋白， DNA雙螺旋分子有許多位點(diǎn)與這些蛋白結(jié)合，形成約 100個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)的 DNA 都是負(fù)超螺旋，一個(gè)小區(qū)的 DNA 有兩個(gè)端點(diǎn)被蛋白質(zhì)固定，每個(gè)小區(qū)相對(duì)獨(dú)立。 環(huán)形 DNA 的拓?fù)鋵W(xué)特性 以 260bp 組成的線形 BDNA為例，螺旋周數(shù) 260/=25。 天然 BDNA的局部區(qū)域可以形成 Z0DNA。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)的 Pribnow 框的 DNA區(qū)中，富含 A T 對(duì)。 ④堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。磷酸與脫氧核糖彼此通過(guò)3/、 5/磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成 DNA分子的骨架。 c. DNA堿基組成沒(méi)有組織和器官的特異性。 一、 DNA 的一級(jí)結(jié)構(gòu) DNA 的一級(jí)結(jié)構(gòu)是 4 種脫氧核苷酸（ dAMP、 dGMP、 dCMP、 dTMP）通過(guò) 3/、 5/磷酸二酯鍵連接起來(lái)的線形多聚體。 核酸中的核苷均為 β型核苷 P332 結(jié)構(gòu)式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷 DNA 的戊糖是：脫氧核糖 RNA 的戊糖是：核糖 三、 核苷酸 核苷中戊糖 C C5 羥基被磷酸酯化，生成核苷酸。 直接證據(jù)： T2 噬菌體 DNA感染 用 35S 標(biāo)記噬菌體蛋白質(zhì)，感染 ，又用 32P 標(biāo)記噬菌體核酸，感染 DNA、 RNA的分布（ DNA在核內(nèi)， RNA在核外）。 TPP 是催化丙酮酸、α 酮戊二酸脫羧反應(yīng)的輔酶。 功能（抗氧劑 — 油脂氧化） 生理功能：抗生殖不育、肌肉委縮、貧血、血細(xì)胞形態(tài)異常 機(jī)理：有抗氧化活性，能防止不飽和脂肪酸自動(dòng)氧化，保護(hù)細(xì)胞膜，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，還可保護(hù)巰基酶的活性。 二、 維 生素 D（ D D3，還有 D D5） P361 有兩種： D3（又名膽鈣化醇）， D2（又名麥角鈣化固醇）。 脂溶性： A、 D、 E、 K，單獨(dú)具有生理功能。 活性形式： 11順式視黃醛 P361 視循環(huán) 視紫紅質(zhì)為弱光感受物，當(dāng)弱光射到視網(wǎng)膜上時(shí)，視紫紅質(zhì)分解，并刺激視神經(jīng)而發(fā)生光覺(jué)。 維生素 D3 （膽鈣化固醇）→ 25羥基膽鈣固醇（肝臟）→ 1， 25 一二羥基膽鈣固醇（腎臟）→小腸（促進(jìn) Ca2+ 的吸收、運(yùn)輸 ）及骨骼（促進(jìn) Ca2+的沉積 ）中，參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝。 一、 維生 B1 與焦磷酸硫胺素（ TPP） P367 化學(xué)名稱：硫胺素， 活性形式：焦磷酸硫胺素（ TPP） 結(jié)構(gòu) P367 結(jié)構(gòu)式： 硫胺素 活性形式： TPP 硫胺素 + ATP Mg2+ TPP + AMP 硫胺素激酶 來(lái)源： 瘦肉、酵母、谷類的胚芽、皮層。 5’— 脫氧腺嘌呤核苷酸鈷胺素是 甲基丙二酸單酰輔酶 A變位酶的輔酶 九、 硫辛酸 丙酮酸脫羧酶復(fù)合體中的輔酶 （硫辛酰氨轉(zhuǎn)乙酰酶和二氫硫辛酰氨脫氫酶的輔酶） 十、 維生素 C 結(jié)構(gòu) 化學(xué)名稱：抗壞血酸 來(lái)源 :食物。 DNA由 A、 G、 C、 T 堿基構(gòu)成。 第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu) 一級(jí)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。 WatsonCrick 雙螺旋結(jié)構(gòu)建立 的根據(jù) ① Chargaff 規(guī)律 1950 年 a. 所有 DNA中， A=T， G=C 且 A+G=C+T。