生物制品生產和檢定用動物細胞基質制備及檢定規(guī)程-免費閱讀
【正文】 (2)試驗中所有試劑及吸頭均需滅菌。 （ 3） 雜交檢測 用經包被液 適當 稀釋的 探針 100μl 包被 DNA 結合板， 4℃ 過夜；次日，用封閉液 37℃ 封閉 60 分鐘 , 洗滌 3 次，備用；擴增結束后，每個反應管中加入變性液 25μl ，混勻；在封閉洗滌后的包被板上每孔加入供試品 25μl ，再加入雜交液 100μl ， 混勻后， 37℃ 反應 60 分鐘，用洗滌液洗滌 5 次；每孔中加入鏈親合素標記的辣根過氧化物酶 100μl ， 37℃ 反應 30 分鐘；同上洗滌 5 次；每孔加入顯色液 100μl ， 37℃ 顯色 10 分鐘；每孔加入終止液 100μl 終止反應。 (3)靈敏度供試品 取鼠源白血病病毒逆轉錄酶（ MMLV）用 A 液進行系列稀釋至 108 U/μ l，充分混勻， 按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩? 試劑 (1)供試品稀釋液 (A 液 ) 每 1L A 液含三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（ TrisHCl,） 25mmol,氯化鉀50mmol, 二硫蘇糖醇 (DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（ EDTA） , TritonX100 25ml,甘油 500ml。 細胞鑒別試驗 按本規(guī)程一（三） 1 項進行，或其他相適應的方法，應確認為本細胞而無其他細胞的交叉污染。 六、檢定用細胞的要求 檢定用細胞是指生物制品制造過程中用于檢定的細胞，包括原代細胞、連續(xù)傳代 細胞或二倍體細胞，以及經特定基因修飾過的細胞。 2． 細胞培養(yǎng)物的檢查 （ 1） 細胞形態(tài)檢查 細胞在接種病毒或用于生產前，其培養(yǎng)物均應進行外觀檢查和鏡檢，應無任何可疑、異常和病變，否則不得用于生產。對各種動物都應有明確健康狀況和潔凈級別要求。與接種病毒的細胞在相同條件下培養(yǎng)， 并按附錄Ⅻ C 生產用細胞外源因子檢查項進行檢測。 6 生產過程細胞培養(yǎng)檢查 （ 1）染色體檢查 可根據制品特性及生產工藝，確定是否進行生產過程中細胞培養(yǎng)的染色體檢查。 可用 G 分帶或 Q 分帶技術檢查 50 個中期細胞染色體帶型，應用照相圖片作出帶型分析。 1．染色體檢查及判定標準 新建人二倍體細胞株及其細胞庫必須進行染色體檢查。所以對生產用傳代細胞系應進行嚴格檢查。其代次不得超過該細胞用于生產的最高限定代次。并設立陽性對照組，對照組至少接種 10 只。 5 致瘤性檢查 某些傳代細胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細胞系 BHK21， CHO，C127 細胞等，或細胞類型屬致瘤性細胞，如雜交瘤細胞，則可不必作致 瘤性檢查。因此，對于人 鼠雜交瘤細胞系則應進行特異性逆轉錄病毒檢測。 ①逆轉錄酶活性測定 ：采用敏感的方法 ,如產品增強的逆轉錄酶活性測定法(PERT)法或其他靈敏度相當的檢測逆轉錄酶的方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中逆轉錄酶活性。接種細胞后，任何動物出現異?；蚣膊【鶓M行原因分析。試驗應設立 病毒陽性對照，包括可觀察細胞病變的病毒陽性對照、血凝陽性對照及血吸附陽性對照。如有必要 ,可以適當換液。細胞鑒別試 驗方法有多種，包括細胞形態(tài)、生物化學法 (如同工酶試驗 )、免疫學檢測 (如 HLA、種特異性抗血清 )、細胞遺傳學檢測 (如染色體核型、標記染色體檢測 )、遺傳標志檢測 (如 DNA 指紋圖譜、 STR圖譜、基因組二核苷重復序列 )等。 （三）細胞檢定 細胞檢定主要包括以下幾個方面：細胞鑒別、外源因子和內源因子的檢查、致瘤性檢查等。 復蘇后細胞的傳代的水平應不超過批準的該細胞用于生產限制最高限定代次。在特定條件下，將一定數量、成分均一的細胞懸液，定量均勻分裝于安瓿，于液氮或 130℃以下凍存，即為原始細胞庫，供建立主細胞庫用。配制各種溶液的化學藥品應符合《中國藥典》（二部）或其他相關國家標準的要求。 應提供細胞培養(yǎng)液的詳細成分，如使用人或動物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物學活性的物質，應具有這些成分的來源、制備方法及質量控制、檢測結果和質量保證的相關資料。 一、對生產用細胞庫細胞基 質總的要求 用于生物制品生產的細胞系 /株均須通過全面檢定，須具有如下相應資料，并經國務院藥品監(jiān)督管理部門批準。 生產非重組制品所用的細胞基質，系指來源于未經修飾的用于制備其主細胞庫的細胞系 /株和原代細胞。 如采用已建株的細胞系 /株，應從具有一定資質的細胞保藏中心獲取細胞，且應提供該細胞在保藏中心的詳細傳代過程，包括培養(yǎng)過程中所使用的原材料的相關信息，具有細胞來源的證明資料 。 消化細胞用胰蛋白酶應進行檢測，證明其無細菌、真菌、支原體或病毒污染。如為引進的細胞，可采用 主細胞庫和工作細胞庫組成的二級細胞庫管理。由 MCB 的細胞經傳代增殖， 達到一定代次水平的細胞，合并后制成一批均質細胞懸液，定量分裝于安瓿或適宜的細胞凍存管，保存于液氮或 130℃以下備用，即為工作細胞庫。凍存 后的細胞，應至少作一次復蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細胞生長情況。每次從 MCB 建立一個新的 WCB，均應按規(guī)定項目進行檢定。 4．細胞內、外源病毒因子檢查 應注意檢查細胞系 /株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于操作帶入的外源性病毒。 （ 2）不同細胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子 將待檢細胞分別接種下列三種單層細胞，包括猴源細胞、人源二倍體細胞和同種屬同組織類型來源的細胞。同時，應進行血吸附試驗 ,應為陰性。豚鼠主要用于檢查細胞內結核分支桿菌，在注射前觀察 4 周，結核菌素試驗為陰性者方可用于試驗。 這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應采用不同的方法聯(lián)合檢測。 人源的細胞系 /株，則應檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細胞病毒、人逆轉錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。 將 MCB 或 WCB 的細胞增殖到或超過生產用體外細胞齡限制代次，再進行致瘤性試驗。 除上述體內法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養(yǎng)試驗等體外法檢測，特別適用于在低代 次時在動物體內無致瘤性的傳代細胞系。 傳代細胞系則以一定稀釋倍數進行傳代，每傳一次為一代。對于在不同 時間收集合并的培養(yǎng)物，應在每次收集時檢測對照細胞培養(yǎng)物。其中至少選擇 50 個分裂中期細胞進
高考資料相關推薦
鄂ICP備17016276號-1