【正文】 (2)試驗(yàn)中所有試劑及吸頭均需滅菌。 （ 3） 雜交檢測 用經(jīng)包被液 適當(dāng) 稀釋的 探針 100μl 包被 DNA 結(jié)合板， 4℃ 過夜；次日，用封閉液 37℃ 封閉 60 分鐘 , 洗滌 3 次，備用；擴(kuò)增結(jié)束后，每個反應(yīng)管中加入變性液 25μl ，混勻；在封閉洗滌后的包被板上每孔加入供試品 25μl ，再加入雜交液 100μl ， 混勻后， 37℃ 反應(yīng) 60 分鐘，用洗滌液洗滌 5 次；每孔中加入鏈親合素標(biāo)記的辣根過氧化物酶 100μl ， 37℃ 反應(yīng) 30 分鐘；同上洗滌 5 次；每孔加入顯色液 100μl ， 37℃ 顯色 10 分鐘；每孔加入終止液 100μl 終止反應(yīng)。 (3)靈敏度供試品 取鼠源白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（ MMLV）用 A 液進(jìn)行系列稀釋至 108 U/μ l，充分混勻， 按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩? 試劑 (1)供試品稀釋液 (A 液 ) 每 1L A 液含三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（ TrisHCl,） 25mmol,氯化鉀50mmol, 二硫蘇糖醇 (DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（ EDTA） , TritonX100 25ml,甘油 500ml。 細(xì)胞鑒別試驗(yàn) 按本規(guī)程一（三） 1 項(xiàng)進(jìn)行，或其他相適應(yīng)的方法，應(yīng)確認(rèn)為本細(xì)胞而無其他細(xì)胞的交叉污染。 六、檢定用細(xì)胞的要求 檢定用細(xì)胞是指生物制品制造過程中用于檢定的細(xì)胞，包括原代細(xì)胞、連續(xù)傳代 細(xì)胞或二倍體細(xì)胞，以及經(jīng)特定基因修飾過的細(xì)胞。 2． 細(xì)胞培養(yǎng)物的檢查 （ 1） 細(xì)胞形態(tài)檢查 細(xì)胞在接種病毒或用于生產(chǎn)前，其培養(yǎng)物均應(yīng)進(jìn)行外觀檢查和鏡檢，應(yīng)無任何可疑、異常和病變，否則不得用于生產(chǎn)。對各種動物都應(yīng)有明確健康狀況和潔凈級別要求。與接種病毒的細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)， 并按附錄Ⅻ C 生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查項(xiàng)進(jìn)行檢測。 6 生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)檢查 （ 1）染色體檢查 可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝，確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的染色體檢查。 可用 G 分帶或 Q 分帶技術(shù)檢查 50 個中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分析。 1．染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn) 新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。所以對生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。并設(shè)立陽性對照組，對照組至少接種 10 只。 5 致瘤性檢查 某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系 BHK21， CHO，C127 細(xì)胞等，或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，則可不必作致 瘤性檢查。因此，對于人 鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。 ①逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定 ：采用敏感的方法 ,如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)法或其他靈敏度相當(dāng)?shù)臋z測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。接種細(xì)胞后，任何動物出現(xiàn)異?；蚣膊【鶓?yīng)進(jìn)行原因分析。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)立 病毒陽性對照，包括可觀察細(xì)胞病變的病毒陽性對照、血凝陽性對照及血吸附陽性對照。如有必要 ,可以適當(dāng)換液。細(xì)胞鑒別試 驗(yàn)方法有多種，包括細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)法 (如同工酶試驗(yàn) )、免疫學(xué)檢測 (如 HLA、種特異性抗血清 )、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測 (如染色體核型、標(biāo)記染色體檢測 )、遺傳標(biāo)志檢測 (如 DNA 指紋圖譜、 STR圖譜、基因組二核苷重復(fù)序列 )等。 （三）細(xì)胞檢定 細(xì)胞檢定主要包括以下幾個方面：細(xì)胞鑒別、外源因子和內(nèi)源因子的檢查、致瘤性檢查等。 復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代的水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的該細(xì)胞用于生產(chǎn)限制最高限定代次。在特定條件下，將一定數(shù)量、成分均一的細(xì)胞懸液，定量均勻分裝于安瓿，于液氮或 130℃以下凍存，即為原始細(xì)胞庫，供建立主細(xì)胞庫用。配制各種溶液的化學(xué)藥品應(yīng)符合《中國藥典》（二部）或其他相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。 應(yīng)提供細(xì)胞培養(yǎng)液的詳細(xì)成分，如使用人或動物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物學(xué)活性的物質(zhì)，應(yīng)具有這些成分的來源、制備方法及質(zhì)量控制、檢測結(jié)果和質(zhì)量保證的相關(guān)資料。 一、對生產(chǎn)用細(xì)胞庫細(xì)胞基 質(zhì)總的要求 用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞系 /株均須通過全面檢定，須具有如下相應(yīng)資料，并經(jīng)國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。 生產(chǎn)非重組制品所用的細(xì)胞基質(zhì)，系指來源于未經(jīng)修飾的用于制備其主細(xì)胞庫的細(xì)胞系 /株和原代細(xì)胞。 如采用已建株的細(xì)胞系 /株，應(yīng)從具有一定資質(zhì)的細(xì)胞保藏中心獲取細(xì)胞，且應(yīng)提供該細(xì)胞在保藏中心的詳細(xì)傳代過程，包括培養(yǎng)過程中所使用的原材料的相關(guān)信息，具有細(xì)胞來源的證明資料 。 消化細(xì)胞用胰蛋白酶應(yīng)進(jìn)行檢測，證明其無細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染。如為引進(jìn)的細(xì)胞，可采用 主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫組成的二級細(xì)胞庫管理。由 MCB 的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖， 達(dá)到一定代次水平的細(xì)胞，合并后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液，定量分裝于安瓿或適宜的細(xì)胞凍存管，保存于液氮或 130℃以下備用，即為工作細(xì)胞庫。凍存 后的細(xì)胞，應(yīng)至少作一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細(xì)胞生長情況。每次從 MCB 建立一個新的 WCB，均應(yīng)按規(guī)定項(xiàng)目進(jìn)行檢定。 4．細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查 應(yīng)注意檢查細(xì)胞系 /株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于操作帶入的外源性病毒。 （ 2）不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子 將待檢細(xì)胞分別接種下列三種單層細(xì)胞，包括猴源細(xì)胞、人源二倍體細(xì)胞和同種屬同組織類型來源的細(xì)胞。同時，應(yīng)進(jìn)行血吸附試驗(yàn) ,應(yīng)為陰性。豚鼠主要用于檢查細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌，在注射前觀察 4 周，結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性者方可用于試驗(yàn)。 這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。 人源的細(xì)胞系 /株，則應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。 將 MCB 或 WCB 的細(xì)胞增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次，再進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)。 除上述體內(nèi)法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或器官培養(yǎng)試驗(yàn)等體外法檢測，特別適用于在低代 次時在動物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系。 傳代細(xì)胞系則以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代，每傳一次為一代。對于在不同 時間收集合并的培養(yǎng)物，應(yīng)在每次收集時檢測對照細(xì)胞培養(yǎng)物。其中至少選擇 50 個分裂中期細(xì)胞進(jìn)