【正文】 。 （ 3）細(xì)胞功能檢查： 用于待檢樣品生物學(xué)活性、 效力或效價測定的檢定用細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項檢查，證明所用細(xì)胞能夠有效評價待檢樣品質(zhì)量。 （ 2） PCR 擴(kuò)增 取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μl 加至 PCR 擴(kuò)增緩沖液 20μl 中， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl 。 (3)加供試品區(qū) 、擴(kuò)增區(qū)及 PCR 產(chǎn)物檢測區(qū)及其所用加樣槍及服裝應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分。 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄 緩沖液 ， 500mg/L BMVRNA ，混勻后，標(biāo)記， 70℃ 放置 10 分鐘，置冰浴。 支原體檢測 依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII B）。 ① 無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII A）。細(xì)胞庫細(xì)胞的檢查應(yīng)按 本規(guī)程‘ 細(xì)胞的檢定’的規(guī)定進(jìn)行，但還應(yīng)進(jìn)行下述檢查： 1 細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性 生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料，包括：重組細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及一定條件下保存時細(xì)胞生產(chǎn)目的產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。 表 2 人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn) 檢查細(xì)胞數(shù) 異 常 1000 500 100 染色單體和染色體斷裂 47 26 8 結(jié)構(gòu)異常 17 10 2 超二倍體 8 5 2 亞二倍體 * 180 90 18 多倍體 ** 30 17 4 * 亞 二倍體如超過上限，可能因制片過程人為地丟失染色體，應(yīng)選同批號標(biāo)本重新計數(shù)。對生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下： 1．用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次 用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，生產(chǎn)代次應(yīng)有一定限制。 ② 陽性對照組應(yīng)至少有 9 只有進(jìn)行性腫瘤生長時，試驗視為有效。 （ 5） 特殊外源病毒因子的檢測 應(yīng)對 MCB 或 WCB 的細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒 的檢測。接種動物未顯示有外源病毒感染，則細(xì)胞判定為合格。 如為貼壁細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞， 細(xì)胞至少培養(yǎng) 14 天后，分別取 1/3 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用 %~% 豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合 懸液進(jìn)行血吸附試驗。這些檢測內(nèi)容對于 MCB細(xì)胞和 WCB 細(xì)胞及生產(chǎn)限定代次細(xì)胞均適用。這些細(xì)胞必須按其特定的質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定，應(yīng)合格。 1．原材料的選擇 建立細(xì)胞庫的各種類型細(xì)胞的供體均應(yīng)符合 本規(guī)程‘ 細(xì)胞的檢定’中相關(guān)規(guī)定。生物制品生產(chǎn)和檢定用 動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程 本規(guī)程適用于人用生物制品生產(chǎn) /檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)，包括具有細(xì)胞庫體系的細(xì)胞及原代細(xì)胞。神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞不得用于生物制品生產(chǎn)。主細(xì)胞庫用于工作細(xì)胞的制備，每個生產(chǎn)企業(yè)的主細(xì)胞庫最多不得超過兩個細(xì)胞代次。 細(xì)胞檢定的基本要求見下表 1。加入紅細(xì)胞后置 2~8℃ 30 分鐘，然后置 20~25℃ 30 分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)紅細(xì)胞吸附應(yīng)為陰性。 表 2 動物體內(nèi)接種法檢測外源病毒因子 動物組 要求 數(shù)量 接種途徑 細(xì)胞濃度 (個活細(xì)胞/ml) 接種細(xì)胞液量 (ml/只 ) 觀察 天數(shù) 結(jié) 果 判 定 乳鼠 24 小時內(nèi) 10(2 窩 ) 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x107 21 應(yīng)健存 成鼠 15~20g 10 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x 107 21 應(yīng)健存 雞胚 * 9~11 日齡 10 尿囊腔 ＞ 1x 107 3~4 尿液血凝 試驗陰性 雞胚 5~6 日齡 10 卵黃囊 ＞ 1x 107 5 應(yīng)存活 豚鼠 350~500g 5 腹腔 ＞ 1x 107 42 應(yīng)健存， 解剖無結(jié)核病變 家兔 ~ 5 皮下 皮內(nèi) ** ＞ 1x 107 21 無異常，健存 * 經(jīng)尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應(yīng)用豚鼠和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行直接紅細(xì)胞凝集試驗。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬、組織來源等確定。 ③ 如試驗組動物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少 1~2 周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動物并進(jìn)行解剖作病理及組織學(xué)檢查。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次，須經(jīng)批準(zhǔn)。 ** 一個中期細(xì)胞內(nèi)超過 53 條染色體即為一個多倍體。 2 鑒別試驗 除按本規(guī)程“ 細(xì)胞鑒別試驗” 進(jìn)行外，還應(yīng)通過檢測目的蛋白基因或蛋白進(jìn)行鑒別試驗。 ② 支原體檢查 依法檢查，應(yīng)符合 規(guī)定（附錄 XII B）。 4. 外源病毒污染檢查 用于待檢樣品外源病毒污染檢查所用的細(xì)胞，應(yīng)采用本規(guī)程一（三） 4（ 2）項及 4（ 3）項雞胚接種檢查，應(yīng)無外源病毒污染。 在相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中分別加入 4μl 已稀釋的供試品、陽性對照及靈敏度供試品，以 A 液作陰性對照。 (4)定期對各區(qū)進(jìn)行消毒， PCR 產(chǎn)物及其加供試品吸頭應(yīng)及時進(jìn)行有效處理。 37℃ 反應(yīng) 90 分鐘。 （ 2）病毒敏感性檢查： 用于活病毒類待檢樣品病毒效價測定的檢定用細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項檢查，證明所用細(xì)胞具有足夠的相應(yīng)病毒敏感性。 ④ 原代細(xì)胞培養(yǎng)物特定病毒檢查 原代猴腎細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)檢查 SV40 病毒、猴艾滋病毒和 B 病毒。 五、原代細(xì)胞的要求 原代細(xì)胞應(yīng)來源于健康的動物臟器組織或胚胎，包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、狗腎或動物的胎兒和其他組織以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織，以適當(dāng)?shù)南合?、分散組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，原代細(xì)胞不能建立細(xì)胞庫，只能限于原始培養(yǎng)的細(xì)胞或傳代少數(shù)幾代內(nèi)（一般 15 代內(nèi)）使用，無法事先標(biāo)定。 3 支原體檢查 每 8~12 世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行支原體檢查，依法檢查， 應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII B）。對于在不同 時間收集合并的培養(yǎng)物，應(yīng)在每次收集時檢測對照細(xì)胞培養(yǎng)物。 除上述體內(nèi)法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養(yǎng)試驗等體外法檢測，特別適用于在低代 次時在動物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系。