生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程(存儲版)
【正文】 行顯微照相，作出核型分析，并應(yīng)粗數(shù) 500 個分裂中期細胞，檢查多倍體的發(fā)生率。 3 支原體檢查 每 8~12 世代細胞培養(yǎng)物，應(yīng)進行支原體檢查，依法檢查， 應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII B）。 （ 3）無菌檢查 依法檢查 ，應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII A）。 五、原代細胞的要求 原代細胞應(yīng)來源于健康的動物臟器組織或胚胎，包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、狗腎或動物的胎兒和其他組織以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織，以適當?shù)南合?、分散組織細胞進行培養(yǎng)，原代細胞不能建立細胞庫，只能限于原始培養(yǎng)的細胞或傳代少數(shù)幾代內(nèi)（一般 15 代內(nèi)）使用，無法事先標定。 胎猴腎可用于生產(chǎn)，對其母猴應(yīng)進行檢疫。 ④ 原代細胞培養(yǎng)物特定病毒檢查 原代猴腎細胞培養(yǎng)應(yīng)檢查 SV40 病毒、猴艾滋病毒和 B 病毒。檢定時從工作細胞庫復蘇細胞后，不能再回凍。 （ 2）病毒敏感性檢查： 用于活病毒類待檢樣品病毒效價測定的檢定用細胞，應(yīng)進行此項檢查，證明所用細胞具有足夠的相應(yīng)病毒敏感性。 (8)變性緩沖液 ， 5mmol/L EDAT。 37℃ 反應(yīng) 90 分鐘。 靈敏度供試品應(yīng)為陽性，且吸光度值應(yīng)不低于 。 (4)定期對各區(qū)進行消毒， PCR 產(chǎn)物及其加供試品吸頭應(yīng)及時進行有效處理。 陰性對照吸光度值應(yīng)不高于 ，如小于 按 計。 在相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中分別加入 4μl 已稀釋的供試品、陽性對照及靈敏度供試品，以 A 液作陰性對照。 (6)擴增緩沖液 每 1L 擴增緩沖液含 TrisHCl() 25mmol, 氯化鉀40mmol,氯化鎂 2mmol,脫氧腺嘌呤核糖核苷酸 200μ mol、脫氧胞嘧啶核糖核 苷酸200μ mol、脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸 200μ mol及脫氧尿嘧啶核糖核苷酸 200μ mol,上、下游引物各 10 － 3 mmol，核糖核酸酶 A ， Taq DNA 聚合酶 610 4U，尿嘧啶 N－糖基化酶（ UNG） 410 4U。 4. 外源病毒污染檢查 用于待檢樣品外源病毒污染檢查所用的細胞，應(yīng)采用本規(guī)程一（三） 4（ 2）項及 4（ 3）項雞胚接種檢查，應(yīng)無外源病毒污染。各 制品應(yīng)根據(jù)其特性以及保證檢測結(jié)果的可靠性基礎(chǔ)上，在該細胞允許的最高限定代次內(nèi)，規(guī)定相應(yīng)檢定用細胞的代次范圍（應(yīng)在確定 細胞代次的177。 ② 支原體檢查 依法檢查，應(yīng)符合 規(guī)定（附錄 XII B）。動物用于制備細胞前，應(yīng)有 6 周以上的檢疫期，檢疫期中出現(xiàn)病猴或混入新猴，應(yīng)重新檢疫。 2 鑒別試驗 除按本規(guī)程“ 細胞鑒別試驗” 進行外，還應(yīng)通過檢測目的蛋白基因或蛋白進行鑒別試驗。 （ 2）細胞鑒別試驗 按本規(guī)程“ 細胞檢定”中細胞鑒別試驗進行。 ** 一個中期細胞內(nèi)超過 53 條染色體即為一個多倍體。 （ 1）染色體檢查 新細胞建株過程中，每 8~12 世代應(yīng)作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應(yīng)有 4 次染色體檢查結(jié)果。用于生物制品生產(chǎn)的細胞最高限定代次，須經(jīng)批準。 體外培養(yǎng)細胞齡的計算 二倍體細胞齡以細胞群體倍增（ Population Doubling）計算，以每個培養(yǎng)容器 細胞群體細胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加一倍作為一世代，即一瓶細胞傳二瓶 (1:2分種率 )，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶 (1:4)為二世代；一瓶傳八瓶 (1:8)則為三世代。 ③ 如試驗組動物有進行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少 1~2 周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動物并進行解剖作病理及組織學檢查。另外，新建細胞系 / 株必須進行致瘤性檢查。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細胞系/株種屬、組織來源等確定。 ③感染性試驗： 將待檢細胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細胞，培養(yǎng)后檢測。 表 2 動物體內(nèi)接種法檢測外源病毒因子 動物組 要求 數(shù)量 接種途徑 細胞濃度 (個活細胞/ml) 接種細胞液量 (ml/只 ) 觀察 天數(shù) 結(jié) 果 判 定 乳鼠 24 小時內(nèi) 10(2 窩 ) 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x107 21 應(yīng)健存 成鼠 15~20g 10 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x 107 21 應(yīng)健存 雞胚 * 9~11 日齡 10 尿囊腔 ＞ 1x 107 3~4 尿液血凝 試驗陰性 雞胚 5~6 日齡 10 卵黃囊 ＞ 1x 107 5 應(yīng)存活 豚鼠 350~500g 5 腹腔 ＞ 1x 107 42 應(yīng)健存， 解剖無結(jié)核病變 家兔 ~ 5 皮下 皮內(nèi) ** ＞ 1x 107 21 無異常，健存 * 經(jīng)尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應(yīng)用豚鼠和雞紅細胞混合懸液進行直接紅細胞凝集試驗。每種接種的單層細胞不得出現(xiàn)細胞病變，血吸附試驗應(yīng)均為陰性。加入紅細胞后置 2~8℃ 30 分鐘，然后置 20~25℃ 30 分鐘，分別進行鏡檢，觀察紅細胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)紅細胞吸附應(yīng)為陰性。 檢測項目 MCB WCB 生產(chǎn)終末細胞 * 細胞鑒別 + + + 無菌檢查 + + + 支原體檢查 + + + 病毒污染檢查： 外源病毒 體外培養(yǎng)法 + + + 體內(nèi)接種法 + + 種屬特異性病毒 + + 逆轉(zhuǎn)錄病毒 + + 細胞致瘤性 + + 2．無菌檢查 取混合細胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII A）。 細胞檢定的基本要求見下表 1。細胞庫中的每支細胞安瓿或細胞凍存管均應(yīng)注明細胞系 /株名、代次、批號、編號、凍存日期，儲存容器的編號等。主細胞庫用于工作細胞的制備，每個生產(chǎn)企業(yè)的主細胞庫最多不得超過兩個細胞代次。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進行非生產(chǎn)制品用細胞或微生物的操作；在同一工作日進行細胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動物。
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