【正文】 鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、 7 天和第 14 天，分別用 抗胸腺血清 (ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種107活細胞。 ③ 如試驗組動物有進行性生長的結節(jié)或可疑病灶，應觀察至少 1~2 周；若出現(xiàn)的結節(jié)在觀察期內(nèi)開始消退，則應在結節(jié)完全消退前，處死動物并進行解剖作病理及組織學檢查。 從凍存的 WCB 中取出一支或多支安瓿，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。 體外培養(yǎng)細胞齡的計算 二倍體細胞齡以細胞群體倍增（ Population Doubling）計算，以每個培養(yǎng)容器 細胞群體細胞數(shù)為基礎，每增加一倍作為一世代，即一瓶細胞傳二瓶 (1:2分種率 )，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶 (1:4)為二世代；一瓶傳八瓶 (1:8)則為三世代。這些細胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強。用于生物制品生產(chǎn)的細胞最高限定代次，須經(jīng)批準。 人二倍體細胞株應在傳代過程的早期，選擇適當世代水平（ 28 世代）增殖出大量細胞，定量分裝后，置液氮中或 – 130℃下凍存，供建立 PCB 之用，待全部檢定合格后，即可正式定為 PCB，供制備 MCB 用。 （ 1）染色體檢查 新細胞建株過程中，每 8~12 世代應作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應有 4 次染色體檢查結果。染色體片應長期保存，以備復查。 ** 一個中期細胞內(nèi)超過 53 條染色體即為一個多倍體。 5 致瘤性檢查 每 8~12 世 代應作一次致瘤性檢查，（方法見本規(guī)程 ‘致瘤性檢查’），結果應無致癌性。 （ 2）細胞鑒別試驗 按本規(guī)程“ 細胞檢定”中細胞鑒別試驗進行。 （ 5） 正常細胞外源病毒因子檢測 制備病毒類制品時，于接種病毒的當天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時，留取此批細胞的 5%(或不少于 500ml)的細胞不接種病毒，換維持液作為正常細胞對照。 2 鑒別試驗 除按本規(guī)程“ 細胞鑒別試驗” 進行外，還應通過檢測目的蛋白基因或蛋白進行鑒別試驗。 （一）動物組織來源和 其他材料 1．動物組織來源 應符合“凡例”的有關要求。動物用于制備細胞前，應有 6 周以上的檢疫期，檢疫期中出現(xiàn)病猴或混入新猴，應重新檢疫。 1．細胞培養(yǎng) 原材料檢查及細胞培養(yǎng)操作按本規(guī)程 “ 原材料的選擇”及“細胞培養(yǎng)操作的環(huán)境要求”進行。 ② 支原體檢查 依法檢查，應符合 規(guī)定（附錄 XII B）。地鼠腎原代細胞應用 BHK21 細胞培養(yǎng)檢查，觀察細胞形態(tài)，如有可疑應在同種細胞上盲傳一代繼續(xù)觀察。各 制品應根據(jù)其特性以及保證檢測結果的可靠性基礎上，在該細胞允許的最高限定代次內(nèi)，規(guī)定相應檢定用細胞的代次范圍（應在確定 細胞代次的177。 （二）細胞檢定 生物制品檢定用細胞應至少進行以下 13 項檢定， 根據(jù)檢定用細胞用途的不同， 還應按照 4 項下的有關要求進行相關的檢定。 4. 外源病毒污染檢查 用于待檢樣品外源病毒污染檢查所用的細胞，應采用本規(guī)程一（三） 4（ 2）項及 4（ 3）項雞胚接種檢查，應無外源病毒污染。 附錄 逆轉錄酶活性檢查法 附錄 IX M 逆轉錄酶活性檢查法 本法系以雀麥草花葉病毒 RNA 為模板，采用 RTPCR 法擴增特定片段并用ELISA 法檢測特異片段與探針的雜交信號，從而測定供試品中的逆轉錄酶活性。 (6)擴增緩沖液 每 1L 擴增緩沖液含 TrisHCl() 25mmol, 氯化鉀40mmol,氯化鎂 2mmol,脫氧腺嘌呤核糖核苷酸 200μ mol、脫氧胞嘧啶核糖核 苷酸200μ mol、脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸 200μ mol及脫氧尿嘧啶核糖核苷酸 200μ mol,上、下游引物各 10 － 3 mmol，核糖核酸酶 A ， Taq DNA 聚合酶 610 4U，尿嘧啶 N－糖基化酶（ UNG） 410 4U。 (2)陽性對照 用 SP2/0 細胞培養(yǎng)上清液作陽性對照，同上處理后，按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩? 在相應的反轉錄反應管中分別加入 4μl 已稀釋的供試品、陽性對照及靈敏度供試品，以 A 液作陰性對照。混勻后，按下列條件進行擴增： 37℃30 分鐘， 預變性 94℃5 分鐘， 94℃45秒， 56℃45 秒， 72℃45 秒，進 行 35 個循環(huán)， 72℃ 延伸 5 分鐘。 陰性對照吸光度值應不高于 ，如小于 按 計。 注意事項 （ 1）如供試品為培養(yǎng)細胞，則將細胞傳代后，培養(yǎng) 34 天長成單層，取上清檢測，取供試品前不得換液。 (4)定期對各區(qū)進行消毒， PCR 產(chǎn)物及其加供試品吸頭應及時進行有效處理。與 RNA 操作有關的試劑及材料均需經(jīng)過 DEPC 處理。 靈敏度供試品應為陽性，且吸光度值應不低于 。以 630nm為參 考波長，于波長 492nm 處測定吸光度。 37℃ 反應 90 分鐘。 檢查法 （ 1） 反轉錄 將已處理的供試品及 陽性對照用 A 液作 10 倍稀釋。 (8)變性緩沖液 ， 5mmol/L EDAT。 (2)供試品保存液 (Ｂ液 ) 每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、 抑胃肽及 1mg 抑蛋白酶肽。 （ 2）病毒敏感性檢查： 用于活病毒類待檢樣品病毒效價測定的檢定用細胞，應進行此項檢查，證明所用細胞具有足夠的相應病毒敏感性。 無菌檢查 依法檢查， 應符合要求（附錄 XII A）。檢定時從工作細胞庫復蘇細胞后，不能再回凍。檢定用細胞的質(zhì)量對檢定結果的判定具有重要的影響，因此，為保證檢定結果的有效性、可靠性及真實性，國家藥品檢定檢定機構和生物制品生產(chǎn)企業(yè)檢定部門所用的檢定用細胞應符合下列要求： （一）細胞資料 檢定用細胞應具有明確的合法來源，及相關的來源證明資料。 ④ 原代細胞培養(yǎng)物特定病毒檢查 原代猴腎細胞培養(yǎng)應檢查 SV40 病毒、猴艾滋病毒和 B 病毒。 （ 2） 對照細胞檢查 每批消化所得原代細胞留取 5% (或至少 500ml)懸液，不接種病毒，細胞濃度和處理均與生產(chǎn)制品過程相同，至少觀察 14 天，并作下列各項檢查，結果均應為陰性。 胎猴腎可用于生產(chǎn)，對其母猴應進行檢疫。 2．生產(chǎn)或檢定用猴 多采用非洲綠猴