【正文】 (3)加供試品區(qū) 、擴(kuò)增區(qū)及 PCR 產(chǎn)物檢測區(qū)及其所用加樣槍及服裝應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分。 供試品吸光度值大于 Cutoff 值者為陽性。 結(jié)果判定 Cutoff 值為陰性對照的吸光度值加 。 （ 2） PCR 擴(kuò)增 取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μl 加至 PCR 擴(kuò)增緩沖液 20μl 中， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl 。 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄 緩沖液 ， 500mg/L BMVRNA ，混勻后，標(biāo)記， 70℃ 放置 10 分鐘，置冰浴。 （ 9）包被液 （ ） 供試品、陽性對照及靈敏度供試品的制備 (1)取供試品 200μl ，每分鐘 5000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取上清液 100μl ，加入B 液 100μl 和焦炭酸二乙醇（ DEPC）處理的 5%Triton X100 2μl ，混勻后，置冰浴 15 分鐘后，置 70℃ 保存?zhèn)溆谩? (3)引物及探針序列 上游引物： 5’ BiotinCGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC3’ 下游引物： 5’ TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC3’ 探 針： 5’ NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG3’ (4)模板 雀麥草花葉病毒 RNA(BMV RNA) (5)反轉(zhuǎn)錄緩沖液 每 1L 反轉(zhuǎn)錄緩沖液含 TrisHCl() 50mmol, 氯化鉀 40mmol, 氯化鎂 6mmol, DTT 10mmol，脫氧核糖核苷酸 200μ mol,下游引物10 － 3 mmol。 （ 3）細(xì)胞功能檢查： 用于待檢樣品生物學(xué)活性、 效力或效價測定的檢定用細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項檢查，證明所用細(xì)胞能夠有效評價待檢樣品質(zhì)量。 支原體檢測 依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII B）。 應(yīng)詳細(xì)記錄檢定用細(xì)胞建庫的過程，包括細(xì)胞培養(yǎng)所用原材料的來源、批號，細(xì)胞生長液的配制方法、使用濃度等，記錄細(xì)胞的傳代及凍存過程，并建立細(xì)胞凍存及使用臺賬。 如使用傳代細(xì)胞系 /株，應(yīng)建立細(xì)胞庫體系，即主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫，如細(xì)胞使用量較少，可建立單一細(xì)胞庫。應(yīng)用 Vero 或原代綠猴腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞檢查。 ① 無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII A）。 （二）原代細(xì)胞培養(yǎng)物的檢查 用于細(xì)胞制備的動物剖檢應(yīng)正常，取留的器官組織亦應(yīng)正常，如有異常，不能用于制備細(xì)胞。應(yīng)為正常健康猴，以籠養(yǎng)或小群混養(yǎng)。因此，只能嚴(yán)格規(guī)范管理和操作措施，以保證以原代細(xì)胞為基質(zhì)所生產(chǎn)的制品質(zhì)量。細(xì)胞庫細(xì)胞的檢查應(yīng)按 本規(guī)程‘ 細(xì)胞的檢定’的規(guī)定進(jìn)行，但還應(yīng)進(jìn)行下述檢查： 1 細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性 生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料，包括：重組細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及一定條件下保存時細(xì)胞生產(chǎn)目的產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。 （ 4） 支原體檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII B）。（見本規(guī)程 “染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)”）但如采用已建株的人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)，則不要求進(jìn)行染色體核型檢查。 4 病毒檢查 二倍體細(xì)胞株傳代過程中，至少對 2 個不同世代水平進(jìn)行病毒包含體、乙型肝炎、丙型肝炎、 EB 病毒，艾滋病病毒進(jìn)行檢查等，結(jié)果應(yīng)均為陰性。 表 2 人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn) 檢查細(xì)胞數(shù) 異 常 1000 500 100 染色單體和染色體斷裂 47 26 8 結(jié)構(gòu)異常 17 10 2 超二倍體 8 5 2 亞二倍體 * 180 90 18 多倍體 ** 30 17 4 * 亞 二倍體如超過上限，可能因制片過程人為地丟失染色體，應(yīng)選同批號標(biāo)本重新計數(shù)。 每次染色體檢查，應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞，混合后進(jìn)行再培養(yǎng)，制備 染色體標(biāo)本片。但如對細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾，則須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查。 三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求 新建的人二倍體細(xì)胞 必須具有以下資料：建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎 兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好的證明（醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調(diào)查資料。對生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下： 1．用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次 用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，生產(chǎn)代次應(yīng)有一定限制。 二、 連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求 傳代細(xì)胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。從 WCB 取出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保存后而再用于生產(chǎn)。 （四）生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境應(yīng)符合本規(guī)程‘細(xì)胞庫的建立’中有關(guān)規(guī)定。 ② 陽性對照組應(yīng)至少有 9 只有進(jìn)行性腫瘤生長時，試驗視為有效。” 下述兩種致癌性試驗方法可任選其一： ①裸鼠 至少 10 只，將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為 5107個 細(xì)胞 /ml，每只裸鼠皮下或肌內(nèi)注射 ；同時用 Hela 或 Hep2 細(xì)胞設(shè)立陽性對照，陽性對照組至少 10 只，每只注射 含 106個細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰性對照，陰性對照組至少 10 只，每只注射 含 1067個細(xì)胞。 人上皮細(xì)胞系、人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系 /株應(yīng)進(jìn)行致瘤性檢查。在某些情況下，也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。 （ 5） 特殊外源病毒因子的檢測 應(yīng)對 MCB 或 WCB 的細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒 的檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時，建議進(jìn)行透射電鏡檢查及感染性試驗，以確證是否有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒存在。在沉淀中加入固定劑，于 4℃保存或直接包埋后制備超薄切片，置于銅網(wǎng)上染色后透射電鏡觀察。家兔主要用于檢測猴來源細(xì)胞中是否存在 B 病毒污染，也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替。接種動物未顯示有外源病毒感染，則細(xì)胞判定為合格。 （ 3）接種動物和雞胚法檢測病毒因子 MCB 或 WCB 細(xì)胞、增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞須采用動物體內(nèi)接種法進(jìn)行外源病毒因子檢測。 在培養(yǎng)第 7 天時，分別取每種接種的單層細(xì)胞上清液各一瓶，分別接種于新鮮制備的相應(yīng)的單層細(xì)