【正文】 法，但均須經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可。細(xì)胞表型特征與遺傳學(xué)特征相結(jié)合來判斷，更有利于細(xì)胞鑒別。 檢測項目 MCB WCB 生產(chǎn)終末細(xì)胞 * 細(xì)胞鑒別 + + + 無菌檢查 + + + 支原體檢查 + + + 病毒污染檢查： 外源病毒 體外培養(yǎng)法 + + + 體內(nèi)接種法 + + 種屬特異性病毒 + + 逆轉(zhuǎn)錄病毒 + + 細(xì)胞致瘤性 + + 2．無菌檢查 取混合細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII A）。 3．支原體檢查 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII B 進(jìn)行），應(yīng)為陰性。 4．細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查 應(yīng)注意檢查細(xì)胞系 /株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于操作帶入的外源性病毒。細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法，須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、組織來源及細(xì)胞特性決定。 （ 1）細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗 取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少 6 個細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。如有必要 ,可以適當(dāng)換液。每日鏡檢細(xì)胞，細(xì)胞應(yīng)保持正常形態(tài)特征。 如為貼壁細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞， 細(xì)胞至少培養(yǎng) 14 天后，分別取 1/3 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用 %~% 豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合 懸液進(jìn)行血吸附試驗。加入紅細(xì)胞后置 2~8℃ 30 分鐘，然后置 20~25℃ 30 分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)紅細(xì)胞吸附應(yīng)為陰性。 新鮮紅細(xì)胞在 2~8℃保存不得超過 7 天 , 且溶液中不應(yīng)含有鈣或鎂離子。 （ 2）不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子 將待檢細(xì)胞分別接種下列三種單層細(xì)胞，包括猴源細(xì)胞、人源二倍體細(xì)胞和同種屬同組織類型來源的細(xì)胞。每種單層細(xì)胞接種至少 107個含有原細(xì)胞培養(yǎng)上清液的活細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解物，每種細(xì)胞至少接種 2 瓶。接種供試品量應(yīng)占維持液的 1/4 以上，培養(yǎng)至少 14 天。試驗應(yīng)設(shè)立 病毒陽性對照，包括可觀察細(xì)胞病變的病毒陽性對照、血凝陽性對照及血吸附陽性對照。如細(xì)胞裂解物對單層細(xì)胞有干擾，則應(yīng)排除干擾因素。 在培養(yǎng)第 7 天時，分別取每種接種的單層細(xì)胞上清液各一瓶，分別接種于新鮮制備的相應(yīng)的單層細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng) 7 天，觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗。每種接種的單層細(xì)胞不得出現(xiàn)細(xì)胞病變，血吸附試驗應(yīng)均為陰性。 若待檢細(xì)胞已知可支持人巨細(xì)胞病毒 (CMV)的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察 28 天，應(yīng)無細(xì)胞病變。同時，應(yīng)進(jìn)行血吸附試驗 ,應(yīng)為陰性。 （ 3）接種動物和雞胚法檢測病毒因子 MCB 或 WCB 細(xì)胞、增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞須采用動物體內(nèi)接種法進(jìn)行外源病毒因子檢測。選用乳鼠、成鼠和雞胚 (兩組不同日齡 )共計 4 組， 按表 2 所列方法進(jìn)行試驗和觀察。接種細(xì)胞后，任何動物出現(xiàn)異?；蚣膊【鶓?yīng)進(jìn)行原因分析。觀察到期時，應(yīng)至少有 80%以上接種動物或雞胚健存，視為試驗有效。接種動物未顯示有外源病毒感染，則細(xì)胞判定為合格。 表 2 動物體內(nèi)接種法檢測外源病毒因子 動物組 要求 數(shù)量 接種途徑 細(xì)胞濃度 (個活細(xì)胞/ml) 接種細(xì)胞液量 (ml/只 ) 觀察 天數(shù) 結(jié) 果 判 定 乳鼠 24 小時內(nèi) 10(2 窩 ) 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x107 21 應(yīng)健存 成鼠 15~20g 10 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x 107 21 應(yīng)健存 雞胚 * 9~11 日齡 10 尿囊腔 ＞ 1x 107 3~4 尿液血凝 試驗陰性 雞胚 5~6 日齡 10 卵黃囊 ＞ 1x 107 5 應(yīng)存活 豚鼠 350~500g 5 腹腔 ＞ 1x 107 42 應(yīng)健存， 解剖無結(jié)核病變 家兔 ~ 5 皮下 皮內(nèi) ** ＞ 1x 107 21 無異常，健存 * 經(jīng)尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應(yīng)用豚鼠和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行直接紅細(xì)胞凝集試驗。 **每只家兔于皮內(nèi)注射 10 處 每處 對于新建細(xì)胞系 /株，還應(yīng)接種豚鼠和家兔（見表 1）。豚鼠主要用于檢查細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌，在注射前觀察 4 周，結(jié)核菌素試驗為陰性者方可用于試驗。家兔主要用于檢測猴來源細(xì)胞中是否存在 B 病毒污染，也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替。 （ 4）逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測 可采用下列方法對 MCB 或 WCB 細(xì)胞、增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。 ①逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定 ：采用敏感的方法 ,如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)法或其他靈敏度相當(dāng)?shù)臋z測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 ②透射電鏡檢查： 收集待檢細(xì)胞，低速離心后，棄上清，沉淀中應(yīng)含有 1107個細(xì)胞，且細(xì)胞存活率應(yīng)不低于 99%。在沉淀中加入固定劑，于 4℃保存或直接包埋后制備超薄切片，置于銅網(wǎng)上染色后透射電鏡觀察。 ③感染性試驗： 將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來 源，須使用不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗。 這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時，建議進(jìn)行透射電鏡檢查及感染性試驗，以確證是否有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒存在。 小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，對于人 鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系，則可不檢測特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)工藝中應(yīng)增加病毒滅活程序。 （ 5） 特殊外源病毒因子的檢測 應(yīng)對 MCB 或 WCB 的細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒 的檢測。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬、組織來源等確定。 如鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗檢測其種特異病毒。 人源