生物制品生產和檢定用動物細胞基質制備及檢定規(guī)程-文庫吧
2025-07-17 11:29 本頁面
【正文】 法，但均須經國家藥品檢定機構認可。細胞表型特征與遺傳學特征相結合來判斷，更有利于細胞鑒別。 檢測項目 MCB WCB 生產終末細胞 * 細胞鑒別 + + + 無菌檢查 + + + 支原體檢查 + + + 病毒污染檢查： 外源病毒 體外培養(yǎng)法 + + + 體內接種法 + + 種屬特異性病毒 + + 逆轉錄病毒 + + 細胞致瘤性 + + 2．無菌檢查 取混合細胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應符合要求（附錄 XII A）。 3．支原體檢查 取細胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應符合要求（附錄 XII B 進行），應為陰性。 4．細胞內、外源病毒因子檢查 應注意檢查細胞系 /株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于操作帶入的外源性病毒。細胞進行病毒檢查的種類及方法，須根據(jù)細胞的種屬來源、組織來源及細胞特性決定。 （ 1）細胞形態(tài)觀察及血吸附試驗 取混合瓶細胞樣品，接種至少 6 個細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細胞長成單層后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。如有必要 ,可以適當換液。每日鏡檢細胞，細胞應保持正常形態(tài)特征。 如為貼壁細胞或半貼壁細胞， 細胞至少培養(yǎng) 14 天后，分別取 1/3 細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用 %~% 豚鼠紅細胞和雞紅細胞混合 懸液進行血吸附試驗。加入紅細胞后置 2~8℃ 30 分鐘，然后置 20~25℃ 30 分鐘，分別進行鏡檢，觀察紅細胞吸附情況，結果應紅細胞吸附應為陰性。 新鮮紅細胞在 2~8℃保存不得超過 7 天 , 且溶液中不應含有鈣或鎂離子。 （ 2）不同細胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子 將待檢細胞分別接種下列三種單層細胞，包括猴源細胞、人源二倍體細胞和同種屬同組織類型來源的細胞。每種單層細胞接種至少 107個含有原細胞培養(yǎng)上清液的活細胞懸液或細胞裂解物，每種細胞至少接種 2 瓶。接種供試品量應占維持液的 1/4 以上，培養(yǎng)至少 14 天。試驗應設立 病毒陽性對照，包括可觀察細胞病變的病毒陽性對照、血凝陽性對照及血吸附陽性對照。如細胞裂解物對單層細胞有干擾，則應排除干擾因素。 在培養(yǎng)第 7 天時，分別取每種接種的單層細胞上清液各一瓶，分別接種于新鮮制備的相應的單層細胞上，繼續(xù)培養(yǎng) 7 天，觀察細胞病變并進行細胞形態(tài)觀察及血吸附試驗。每種接種的單層細胞不得出現(xiàn)細胞病變，血吸附試驗應均為陰性。 若待檢細胞已知可支持人巨細胞病毒 (CMV)的生長，則應在接種人二倍體細胞后至少觀察 28 天，應無細胞病變。同時，應進行血吸附試驗 ,應為陰性。 （ 3）接種動物和雞胚法檢測病毒因子 MCB 或 WCB 細胞、增殖到或超過生產用體外細胞齡限制代次的細胞須采用動物體內接種法進行外源病毒因子檢測。選用乳鼠、成鼠和雞胚 (兩組不同日齡 )共計 4 組， 按表 2 所列方法進行試驗和觀察。接種細胞后，任何動物出現(xiàn)異常或疾病均應進行原因分析。觀察到期時，應至少有 80%以上接種動物或雞胚健存，視為試驗有效。接種動物未顯示有外源病毒感染，則細胞判定為合格。 表 2 動物體內接種法檢測外源病毒因子 動物組 要求 數(shù)量 接種途徑 細胞濃度 (個活細胞/ml) 接種細胞液量 (ml/只 ) 觀察 天數(shù) 結 果 判 定 乳鼠 24 小時內 10(2 窩 ) 腦內 腹腔 ＞ 1x107 21 應健存 成鼠 15~20g 10 腦內 腹腔 ＞ 1x 107 21 應健存 雞胚 * 9~11 日齡 10 尿囊腔 ＞ 1x 107 3~4 尿液血凝 試驗陰性 雞胚 5~6 日齡 10 卵黃囊 ＞ 1x 107 5 應存活 豚鼠 350~500g 5 腹腔 ＞ 1x 107 42 應健存， 解剖無結核病變 家兔 ~ 5 皮下 皮內 ** ＞ 1x 107 21 無異常，健存 * 經尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應用豚鼠和雞紅細胞混合懸液進行直接紅細胞凝集試驗。 **每只家兔于皮內注射 10 處 每處 對于新建細胞系 /株，還應接種豚鼠和家兔（見表 1）。豚鼠主要用于檢查細胞內結核分支桿菌，在注射前觀察 4 周，結核菌素試驗為陰性者方可用于試驗。家兔主要用于檢測猴來源細胞中是否存在 B 病毒污染，也可用兔腎細胞培養(yǎng)法代替。 （ 4）逆轉錄病毒及其他內源性病毒或病毒核酸的檢測 可采用下列方法對 MCB 或 WCB 細胞、增殖到或超過生產用體外細胞齡限制代次的細胞進行逆轉錄病毒的檢測。 ①逆轉錄酶活性測定 ：采用敏感的方法 ,如產品增強的逆轉錄酶活性測定法(PERT)法或其他靈敏度相當?shù)臋z測逆轉錄酶的方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中逆轉錄酶活性。 ②透射電鏡檢查： 收集待檢細胞，低速離心后，棄上清，沉淀中應含有 1107個細胞，且細胞存活率應不低于 99%。在沉淀中加入固定劑，于 4℃保存或直接包埋后制備超薄切片，置于銅網上染色后透射電鏡觀察。 ③感染性試驗： 將待檢細胞感染逆轉錄病毒敏感細胞，培養(yǎng)后檢測。根據(jù)待檢細胞的種屬來 源，須使用不同的敏感細胞進行感染性試驗。 這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉錄酶活性檢測陽性時，建議進行透射電鏡檢查及感染性試驗，以確證是否有感染性逆轉錄病毒顆粒存在。 小鼠來源和其他嚙齒類來源的細胞系或其雜交瘤細胞系有可能攜帶潛在的逆轉錄病毒。因此，對于人 鼠雜交瘤細胞系則應進行特異性逆轉錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產的小鼠細胞系，則可不檢測特異性的逆轉錄病毒，但在生產工藝中應增加病毒滅活程序。 （ 5） 特殊外源病毒因子的檢測 應對 MCB 或 WCB 的細胞進行特殊病毒 的檢測。檢測病毒的種類應根據(jù)細胞系/株種屬、組織來源等確定。 如鼠源的細胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產生試驗檢測其種特異病毒。 人源
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