【文章內(nèi)容簡介】 的細(xì)胞系 /株，則應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情況下，也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù)。 5 致瘤性檢查 某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系 BHK21， CHO，C127 細(xì)胞等，或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，則可不必作致 瘤性檢查。 某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有致癌性，而超過某代次則具有致瘤性，如 VERO 細(xì)胞，則必須進(jìn)行致瘤性檢查。 人上皮細(xì)胞系、人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系 /株應(yīng)進(jìn)行致瘤性檢查。另外，新建細(xì)胞系 / 株必須進(jìn)行致瘤性檢查。 在某些情況下，用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查。 將 MCB 或 WCB 的細(xì)胞增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次，再進(jìn)行致瘤性試驗。” 下述兩種致癌性試驗方法可任選其一： ①裸鼠 至少 10 只，將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為 5107個 細(xì)胞 /ml，每只裸鼠皮下或肌內(nèi)注射 ；同時用 Hela 或 Hep2 細(xì)胞設(shè)立陽性對照，陽性對照組至少 10 只，每只注射 含 106個細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰性對照，陰性對照組至少 10 只，每只注射 含 1067個細(xì)胞。 ②新生小鼠 (3~5 日齡 )， 8~10g 小鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、 7 天和第 14 天，分別用 抗胸腺血清 (ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種107活細(xì)胞。并設(shè)立陽性對照組，對照組至少接種 10 只。 結(jié)果判定： ① 定期觀察并觸摸注射部位有無結(jié)節(jié)形成，且形成的 任何結(jié)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行雙向測量并記錄。 ② 陽性對照組應(yīng)至少有 9 只有進(jìn)行性腫瘤生長時，試驗視為有效。 ③ 如試驗組動物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少 1~2 周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動物并進(jìn)行解剖作病理及組織學(xué)檢查。 ④未發(fā)生結(jié)節(jié)的動物半數(shù)應(yīng)觀察 21 天，剖檢，另外半數(shù)動物應(yīng)觀察 12 周，進(jìn)行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成，如有懷疑，進(jìn)行病理組織檢查，不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成。 除上述體內(nèi)法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養(yǎng)試驗等體外法檢測，特別適用于在低代 次時在動物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系。 （四）生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境應(yīng)符合本規(guī)程‘細(xì)胞庫的建立’中有關(guān)規(guī)定。 從凍存的 WCB 中取出一支或多支安瓿，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。生產(chǎn)用細(xì)胞的最高限定代次應(yīng)根據(jù)研究結(jié)果確定，但不得超過國際認(rèn)可的最高限定代次。從 WCB 取出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保存后而再用于生產(chǎn)。 體外培養(yǎng)細(xì)胞齡的計算 二倍體細(xì)胞齡以細(xì)胞群體倍增（ Population Doubling）計算，以每個培養(yǎng)容器 細(xì)胞群體細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加一倍作為一世代，即一瓶細(xì)胞傳二瓶 (1:2分種率 )，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶 (1:4)為二世代；一瓶傳八瓶 (1:8)則為三世代。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì)胞壽命期限的前 2/3 內(nèi)。 傳代細(xì)胞系則以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代，每傳一次為一代。 二、 連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求 傳代細(xì)胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。這些細(xì)胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強(qiáng)。所以對生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。應(yīng)按 本規(guī)程‘細(xì)胞的檢定’ 的規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞庫的檢查。對生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下： 1．用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次 用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，生產(chǎn)代次應(yīng)有一定限制。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次，須經(jīng)批準(zhǔn)。 2．生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)物檢查： 對于病毒類制品， 在生產(chǎn)末期，應(yīng)按照本規(guī)程中的三 .6（ 2）、（ 3）、（ 4）和（ 5）對生產(chǎn)對照用細(xì)胞進(jìn)行檢查，并合格。對于在不同 時間收集合并的培養(yǎng)物，應(yīng)在每次收集時檢測對照細(xì)胞培養(yǎng)物。 三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求 新建的人二倍體細(xì)胞 必須具有以下資料：建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎 兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好的證明（醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調(diào)查資料。 人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過程的早期，選擇適當(dāng)世代水平（ 28 世代）增殖出大量細(xì)胞，定量分裝后，置液氮中或 – 130℃下凍存，供建立 PCB 之用，待全部檢定合格后，即可正式定為 PCB，供制備 MCB 用。 1．染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn) 新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。對于已建株的人二倍體細(xì)胞株，如 WI3 MRC 2BS， KMB17 等，在建立 MCB 時可不必進(jìn)行細(xì)胞染色體檢查。但如對細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾，則須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查。 （ 1）染色體檢查 新細(xì)胞建株過程中，每 8~12 世代應(yīng)作一次染色體檢查，一株細(xì)胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應(yīng)有 4 次染色體檢查結(jié)果。 每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機(jī)取 1000 個分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并作記錄以備復(fù)查。其中至少選擇 50 個分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相，作出核型分析，并應(yīng)粗?jǐn)?shù) 500 個分裂中期細(xì)胞，檢查多倍體的發(fā)生率。 每次染色體檢查，應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞，混合后進(jìn)行再培養(yǎng)，制備 染色體標(biāo)本片。染色體片應(yīng)長期保存，以備復(fù)查。 可用 G 分帶或 Q 分帶技術(shù)檢查 50 個中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分析。 （ 2）判定標(biāo)準(zhǔn) 對 1000 個和 500 個中期細(xì)胞標(biāo)本異常率進(jìn)行檢查，合格的上限 (可信限 90% Poison 法 )如表 2。 表 2 人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn) 檢查細(xì)胞數(shù) 異 常 1000 500 100 染色單體和染色體斷裂 47 26 8 結(jié)構(gòu)異常 17 10 2 超二倍體 8 5 2 亞二倍體 * 180 90 18 多倍體 ** 30 17 4 *