【正文】 胞上，繼續(xù)培養(yǎng) 7 天，觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)。每種單層細(xì)胞接種至少 107個(gè)含有原細(xì)胞培養(yǎng)上清液的活細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解物，每種細(xì)胞至少接種 2 瓶。 如為貼壁細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞， 細(xì)胞至少培養(yǎng) 14 天后，分別取 1/3 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用 %~% 豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合 懸液進(jìn)行血吸附試驗(yàn)。細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法，須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、組織來源及細(xì)胞特性決定。細(xì)胞表型特征與遺傳學(xué)特征相結(jié)合來判斷，更有利于細(xì)胞鑒別。 表 細(xì)胞檢定項(xiàng)目要求 *生產(chǎn)終末細(xì)胞 :是指按生產(chǎn)規(guī)模制備的終末代次細(xì)胞。這些檢測內(nèi)容對于 MCB細(xì)胞和 WCB 細(xì)胞及生產(chǎn)限定代次細(xì)胞均適用。 主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫分別存放。 4．細(xì)胞庫的管理 每種細(xì)胞庫均應(yīng)分別建立臺(tái)帳，記錄放置位置、容器編號、分裝及凍存數(shù)量，取用記錄等。每個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的工作細(xì)胞庫必須限定為一個(gè)細(xì)胞 代次。這些細(xì)胞必須按其特定的質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定，應(yīng)合格。在某些特殊情況下，也可使用 MCB 一級庫，但須得到國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門的批準(zhǔn)。生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體。特別應(yīng)檢測胰蛋白酶來源的動(dòng)物可能攜帶的病毒，如細(xì)小病毒等。 1．原材料的選擇 建立細(xì)胞庫的各種類型細(xì)胞的供體均應(yīng)符合 本規(guī)程‘ 細(xì)胞的檢定’中相關(guān)規(guī)定。 2．細(xì)胞系 /株培養(yǎng)歷史的資料 應(yīng)具有細(xì)胞分離方法、細(xì)胞體外培養(yǎng)過程及建立細(xì)胞系 /株過程的相關(guān)資料，包括所使用的物理、化學(xué)或生物學(xué)手段，是否有外源添加序列，以及細(xì)胞生長特征、生長液成分、選擇細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或選擇方法等。這些資料最好從細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)室獲得，也可引用正式發(fā)表文獻(xiàn)。生產(chǎn)重組制品的細(xì)胞基質(zhì)，系指含所需序列的、從單個(gè)前體細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。生物制品生產(chǎn)和檢定用 動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程 本規(guī)程適用于人用生物制品生產(chǎn) /檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)，包括具有細(xì)胞庫體系的細(xì)胞及原代細(xì)胞。生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)，系指通過親本骨髓瘤細(xì)胞系與另一親本細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系。 人源細(xì)胞系 /株須具有細(xì)胞系 /株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性別及生理狀況的相關(guān)資料。同時(shí)還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢查 結(jié)果的相關(guān)資料。神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞不得用于生物制品生產(chǎn)。 用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或β 內(nèi)酰胺 (β Lactam)類抗生素。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的操作；在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動(dòng)物。 （ 1）原始細(xì)胞庫 (PCB) 由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體，通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。主細(xì)胞庫用于工作細(xì)胞的制備，每個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的主細(xì)胞庫最多不得超過兩個(gè)細(xì)胞代次。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批或一個(gè)亞批制品。細(xì)胞庫中的每支細(xì)胞安瓿或細(xì)胞凍存管均應(yīng)注明細(xì)胞系 /株名、代次、批號、編號、凍存日期，儲(chǔ)存容器的編號等。非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。 細(xì)胞檢定的基本要求見下表 1。 1．細(xì)胞鑒別試驗(yàn) 新建細(xì)胞系 /株、細(xì)胞庫 (MCB 和 WCB)和生產(chǎn)終末細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為本細(xì)胞，無其他細(xì)胞的交叉污染。 檢測項(xiàng)目 MCB WCB 生產(chǎn)終末細(xì)胞 * 細(xì)胞鑒別 + + + 無菌檢查 + + + 支原體檢查 + + + 病毒污染檢查： 外源病毒 體外培養(yǎng)法 + + + 體內(nèi)接種法 + + 種屬特異性病毒 + + 逆轉(zhuǎn)錄病毒 + + 細(xì)胞致瘤性 + + 2．無菌檢查 取混合細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII A）。 （ 1）細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn) 取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少 6 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。加入紅細(xì)胞后置 2~8℃ 30 分鐘，然后置 20~25℃ 30 分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)紅細(xì)胞吸附應(yīng)為陰性。接種供試品量應(yīng)占維持液的 1/4 以上，培養(yǎng)至少 14 天。每種接種的單層細(xì)胞不得出現(xiàn)細(xì)胞病變，血吸附試驗(yàn)應(yīng)均為陰性。選用乳鼠、成鼠和雞胚 (兩組不同日齡 )共計(jì) 4 組， 按表 2 所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀察。 表 2 動(dòng)物體內(nèi)接種法檢測外源病毒因子 動(dòng)物組 要求 數(shù)量 接種途徑 細(xì)胞濃度 (個(gè)活細(xì)胞/ml) 接種細(xì)胞液量 (ml/只 ) 觀察 天數(shù) 結(jié) 果 判 定 乳鼠 24 小時(shí)內(nèi) 10(2 窩 ) 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x107 21 應(yīng)健存 成鼠 15~20g 10 腦內(nèi) 腹腔 ＞ 1x 107 21 應(yīng)健存 雞胚 * 9~11 日齡 10 尿囊腔 ＞ 1x 107 3~4 尿液血凝 試驗(yàn)陰性 雞胚 5~6 日齡 10 卵黃囊 ＞ 1x 107 5 應(yīng)存活 豚鼠 350~500g 5 腹腔 ＞ 1x 107 42 應(yīng)健存， 解剖無結(jié)核病變 家兔 ~ 5 皮下 皮內(nèi) ** ＞ 1x 107 21 無異常，健存 * 經(jīng)尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應(yīng)用豚鼠和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行直接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。 （ 4）逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測 可采用下列方法對 MCB 或 WCB 細(xì)胞、增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。 ③感染性試驗(yàn)： 將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測。 小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬、組織來源等確定。這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù)。另外，新建細(xì)胞系 / 株必須進(jìn)行致瘤性檢查。 ②新生小鼠 (3~5 日齡 )， 8~10g 小