生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程-資料下載頁
2024-08-20 11:29本頁面
【導讀】系的細胞及原代細胞。細胞基質(zhì)系指可用于生物制品生產(chǎn)/檢定的所有動物或人。源的連續(xù)傳代細胞系、二倍體細胞株及原代細胞。生產(chǎn)重組制品的細胞基質(zhì)，系指含所需序列的、從。單個前體細胞克隆的轉(zhuǎn)染細胞。另一親本細胞融合的雜交瘤細胞系。并經(jīng)國務院藥品監(jiān)督管理部門批準。獲得，也可引用正式發(fā)表文獻。性別及生理狀況的相關資料。地域來源、年齡、性別、病原體檢測結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關資料。細胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢查結(jié)果的相關資料。消化細胞用胰蛋白酶應進行檢測，證明其無細菌、真菌、支原體或病毒污染。胞，可采用主細胞庫和工作細胞庫組成的二級細胞庫管理。也可使用MCB一級庫，但須得到國務院藥品監(jiān)督管理部門的批準。工作細胞庫的細胞由MCB細胞傳代擴增制成。由MCB的細胞經(jīng)傳代增殖，達。水平應不超過批準的該細胞用于生產(chǎn)限制最高限定代次。凍存前細胞活力應在90%以上，復蘇后細胞存活率應不低于85%。操作帶入的外源性病毒。
【正文】 不同， 還應按照 4 項下的有關要求進行相關的檢定。 細胞鑒別試驗 按本規(guī)程一（三） 1 項進行，或其他相適應的方法，應確認為本細胞而無其他細胞的交叉污染。 無菌檢查 依法檢查， 應符合要求（附錄 XII A）。 支原體檢測 依法檢查， 應符合要求（附錄 XII B）。 4. 外源病毒污染檢查 用于待檢樣品外源病毒污染檢查所用的細胞，應采用本規(guī)程一（三） 4（ 2）項及 4（ 3）項雞胚接種檢查，應無外源病毒污染。 其他檢測： （ 1）致瘤性檢查： 對于待檢樣品致瘤性檢查時所用的陽性對照細胞，應采用本規(guī)程一（三） 5項進行檢查，應具有致瘤性。 （ 2）病毒敏感性檢查： 用于活病毒類待檢樣品病毒效價測定的檢定用細胞，應進行此項檢查，證明所用細胞具有足夠的相應病毒敏感性。 （ 3）細胞功能檢查： 用于待檢樣品生物學活性、 效力或效價測定的檢定用細胞，應進行此項檢查，證明所用細胞能夠有效評價待檢樣品質(zhì)量。 附錄 逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法 附錄 IX M 逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法 本法系以雀麥草花葉病毒 RNA 為模板，采用 RTPCR 法擴增特定片段并用ELISA 法檢測特異片段與探針的雜交信號，從而測定供試品中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 試劑 (1)供試品稀釋液 (A 液 ) 每 1L A 液含三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（ TrisHCl,） 25mmol,氯化鉀50mmol, 二硫蘇糖醇 (DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（ EDTA） , TritonX100 25ml,甘油 500ml。 (2)供試品保存液 (Ｂ液 ) 每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、 抑胃肽及 1mg 抑蛋白酶肽。 (3)引物及探針序列 上游引物： 5’ BiotinCGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC3’ 下游引物： 5’ TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC3’ 探 針： 5’ NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG3’ (4)模板 雀麥草花葉病毒 RNA(BMV RNA) (5)反轉(zhuǎn)錄緩沖液 每 1L 反轉(zhuǎn)錄緩沖液含 TrisHCl() 50mmol, 氯化鉀 40mmol, 氯化鎂 6mmol, DTT 10mmol，脫氧核糖核苷酸 200μ mol,下游引物10 － 3 mmol。 (6)擴增緩沖液 每 1L 擴增緩沖液含 TrisHCl() 25mmol, 氯化鉀40mmol,氯化鎂 2mmol,脫氧腺嘌呤核糖核苷酸 200μ mol、脫氧胞嘧啶核糖核 苷酸200μ mol、脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸 200μ mol及脫氧尿嘧啶核糖核苷酸 200μ mol,上、下游引物各 10 － 3 mmol，核糖核酸酶 A ， Taq DNA 聚合酶 610 4U，尿嘧啶 N－糖基化酶（ UNG） 410 4U。 （ 7）封閉液 3%牛血清白蛋白或 %酪蛋白溶液。 (8)變性緩沖液 ， 5mmol/L EDAT。 （ 9）包被液 （ ） 供試品、陽性對照及靈敏度供試品的制備 (1)取供試品 200μl ，每分鐘 5000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取上清液 100μl ，加入B 液 100μl 和焦炭酸二乙醇（ DEPC）處理的 5%Triton X100 2μl ，混勻后，置冰浴 15 分鐘后，置 70℃ 保存?zhèn)溆谩? (2)陽性對照 用 SP2/0 細胞培養(yǎng)上清液作陽性對照，同上處理后，按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩? (3)靈敏度供試品 取鼠源白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（ MMLV）用 A 液進行系列稀釋至 108 U/μ l，充分混勻， 按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩? 檢查法 （ 1） 反轉(zhuǎn)錄 將已處理的供試品及 陽性對照用 A 液作 10 倍稀釋。 反轉(zhuǎn)錄 反應管中加入反轉(zhuǎn)錄 緩沖液 ， 500mg/L BMVRNA ，混勻后，標記， 70℃ 放置 10 分鐘，置冰浴。 在相應的反轉(zhuǎn)錄反應管中分別加入 4μl 已稀釋的供試品、陽性對照及靈敏度供試品，以 A 液作陰性對照。反轉(zhuǎn)錄反應體系為 25μl 。 37℃ 反應 90 分鐘。 （ 2） PCR 擴增 取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μl 加至 PCR 擴增緩沖液 20μl 中， PCR 擴增反應體系為25μl ?；靹蚝?，按下列條件進行擴增： 37℃30 分鐘， 預變性 94℃5 分鐘， 94℃45秒， 56℃45 秒， 72℃45 秒，進 行 35 個循環(huán)， 72℃ 延伸 5 分鐘。 （ 3） 雜交檢測 用經(jīng)包被液 適當 稀釋的 探針 100μl 包被 DNA 結(jié)合板， 4℃ 過夜；次日，用封閉液 37℃ 封閉 60 分鐘 , 洗滌 3 次，備用；擴增結(jié)束后，每個反應管中加入變性液 25μl ，混勻；在封閉洗滌后的包被板上每孔加入供試品 25μl ，再加入雜交液 100μl ， 混勻后， 37℃ 反應 60 分鐘，用洗滌液洗滌 5 次；每孔中加入鏈親合素標記的辣根過氧化物酶 100μl ， 37℃ 反應 30 分鐘；同上洗滌 5 次；每孔加入顯色液 100μl ， 37℃ 顯色 10 分鐘；每孔加入終止液 100μl 終止反應。以 630nm為參 考波長，于波長 492nm 處測定吸光度。 結(jié)果判定 Cutoff 值為陰性對照的吸光度值加 。 陰性對照吸光度值應不高于 ，如小于 按 計。 陽性對照應為陽性，且吸光度值應不低于 。 靈敏度供試品應為陽性，且吸光度值應不低于 。 供試品吸光度值大于 Cutoff 值者為陽性。 注意事項 （ 1）如供試品為培養(yǎng)細胞，則將細胞傳代后，培養(yǎng) 34 天長成單層，取上清檢測，取供試品前不得換液。 (2)試驗中所有試劑及吸頭均需滅菌。與 RNA 操作有關的試劑及材料均需經(jīng)過 DEPC 處理。 (3)加供試品區(qū) 、擴增區(qū)及 PCR 產(chǎn)物檢測區(qū)及其所用加樣槍及服裝應嚴格區(qū)分。 (4)定期對各區(qū)進行消毒， PCR 產(chǎn)物及其加供試品吸頭應及時進行有效處理。
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