【正文】 工作細(xì)胞庫的細(xì)胞由 MCB 細(xì)胞傳代擴(kuò)增制成。 復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代的水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的該細(xì)胞用于生產(chǎn)限制最高限定代次。 凍存前細(xì)胞活力應(yīng)在 90%以上，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率應(yīng)不低于 85%。 （三）細(xì)胞檢定 細(xì)胞檢定主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞鑒別、外源因子和內(nèi)源因子的檢查、致瘤性檢查等。細(xì)胞庫建立后應(yīng)至少對(duì) MCB 細(xì)胞及生產(chǎn)終末細(xì)胞進(jìn)行一次全面檢定。細(xì)胞鑒別試 驗(yàn)方法有多種，包括細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)法 (如同工酶試驗(yàn) )、免疫學(xué)檢測 (如 HLA、種特異性抗血清 )、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測 (如染色體核型、標(biāo)記染色體檢測 )、遺傳標(biāo)志檢測 (如 DNA 指紋圖譜、 STR圖譜、基因組二核苷重復(fù)序列 )等。 3．支原體檢查 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII B 進(jìn)行），應(yīng)為陰性。如有必要 ,可以適當(dāng)換液。 新鮮紅細(xì)胞在 2~8℃保存不得超過 7 天 , 且溶液中不應(yīng)含有鈣或鎂離子。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)立 病毒陽性對(duì)照，包括可觀察細(xì)胞病變的病毒陽性對(duì)照、血凝陽性對(duì)照及血吸附陽性對(duì)照。 若待檢細(xì)胞已知可支持人巨細(xì)胞病毒 (CMV)的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察 28 天，應(yīng)無細(xì)胞病變。接種細(xì)胞后，任何動(dòng)物出現(xiàn)異?；蚣膊【鶓?yīng)進(jìn)行原因分析。 **每只家兔于皮內(nèi)注射 10 處 每處 對(duì)于新建細(xì)胞系 /株，還應(yīng)接種豚鼠和家兔（見表 1）。 ①逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定 ：采用敏感的方法 ,如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)法或其他靈敏度相當(dāng)?shù)臋z測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來 源，須使用不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗(yàn)。因此，對(duì)于人 鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。 如鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)檢測其種特異病毒。 5 致瘤性檢查 某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系 BHK21， CHO，C127 細(xì)胞等，或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，則可不必作致 瘤性檢查。 在某些情況下，用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查。并設(shè)立陽性對(duì)照組，對(duì)照組至少接種 10 只。 ④未發(fā)生結(jié)節(jié)的動(dòng)物半數(shù)應(yīng)觀察 21 天，剖檢，另外半數(shù)動(dòng)物應(yīng)觀察 12 周，進(jìn)行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成，如有懷疑，進(jìn)行病理組織檢查，不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成。其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì)胞壽命期限的前 2/3 內(nèi)。所以對(duì)生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。 2．生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)物檢查： 對(duì)于病毒類制品， 在生產(chǎn)末期，應(yīng)按照本規(guī)程中的三 .6（ 2）、（ 3）、（ 4）和（ 5）對(duì)生產(chǎn)對(duì)照用細(xì)胞進(jìn)行檢查，并合格。 1．染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn) 新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。 每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機(jī)取 1000 個(gè)分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并作記錄以備復(fù)查。 可用 G 分帶或 Q 分帶技術(shù)檢查 50 個(gè)中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分析。 2 無菌檢查 每 8~12 世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行無菌檢查， 依法檢查， 應(yīng)符合規(guī)定（附錄 XII A）。 6 生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)檢查 （ 1）染色體檢查 可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝，確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的染色體檢查。對(duì)于每個(gè)制品生產(chǎn)用細(xì)胞每年應(yīng)至少進(jìn)行一次該項(xiàng)檢定。與接種病毒的細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)， 并按附錄Ⅻ C 生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查項(xiàng)進(jìn)行檢測。 3 重組細(xì)胞產(chǎn)物的外源病毒因子檢測 應(yīng)按 本規(guī)程“細(xì)胞形態(tài)觀 察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)”和“不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢病毒因子”的 要求對(duì)細(xì)胞裂解物或收獲液及生產(chǎn)用培養(yǎng)基進(jìn)行外源病毒因子的檢測。對(duì)各種動(dòng)物都應(yīng)有明確健康狀況和潔凈級(jí)別要求。從外面新引入猴群應(yīng)作結(jié)核菌素試驗(yàn)及猴皰疹 I 型病毒 (B 病毒 )的檢查。 2． 細(xì)胞培養(yǎng)物的檢查 （ 1） 細(xì)胞形態(tài)檢查 細(xì)胞在接種病毒或用于生產(chǎn)前，其培養(yǎng)物均應(yīng)進(jìn)行外觀檢查和鏡檢，應(yīng)無任何可疑、異常和病變，否則不得用于生產(chǎn)。 ③外源病毒污染的檢查 對(duì)觀察到期的細(xì)胞，按本規(guī)程 4（ 1）項(xiàng)“ 細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)”和4（ 2）項(xiàng)“ 不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子” 項(xiàng)進(jìn)行外源病毒污染檢測。 六、檢定用細(xì)胞的要求 檢定用細(xì)胞是指生物制品制造過程中用于檢定的細(xì)胞，包括原代細(xì)胞、連續(xù)傳代 細(xì)胞或二倍體細(xì)胞，以及經(jīng)特定基因修飾過的細(xì)胞。 1 代范圍內(nèi)） 。 細(xì)胞鑒別試驗(yàn) 按本規(guī)程一（三） 1 項(xiàng)進(jìn)行，或其他相適應(yīng)的方法，應(yīng)確認(rèn)為本細(xì)胞而無其他細(xì)胞的交叉污染。 其他檢測： （ 1）致瘤性檢查： 對(duì)于待檢樣品致瘤性檢查時(shí)所用的陽性對(duì)照細(xì)胞，應(yīng)采用本規(guī)程一（三） 5項(xiàng)進(jìn)行檢查，應(yīng)具有致瘤性。 試劑 (1)供試品稀釋液 (A 液 ) 每 1L A 液含三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（ TrisHCl,） 25mmol,氯化鉀50mmol, 二硫蘇糖醇 (DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（ EDTA） , TritonX100 25ml,甘油 500ml。 （ 7）封閉液 3%牛血清白蛋白或 %酪蛋白溶液。 (3)靈敏度供試品 取鼠源白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（ MMLV）用 A 液進(jìn)行系列稀釋至 108 U/μ l，充分混勻， 按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 25μl 。 （ 3） 雜交檢測 用經(jīng)包被液 適當(dāng) 稀釋的 探針 100μl 包被 DNA 結(jié)合板， 4℃ 過夜；次日，用封閉液 37℃ 封閉 60 分鐘 , 洗滌 3 次，備用；擴(kuò)增結(jié)束后，每個(gè)反應(yīng)管中加入變性液 25μl ，混勻；在封閉洗滌后的包被板上每孔加入供試品 25μl ，再加入雜交液 100μl ， 混勻后， 37℃ 反應(yīng) 60 分鐘，用洗滌液洗滌 5 次；每孔中加入鏈親合素標(biāo)記的辣根過氧化物酶 100μl ， 37℃ 反應(yīng) 30 分鐘；同上洗滌 5 次；每孔加入顯色液 100μl ， 37℃ 顯色 10 分鐘；每孔加入終止液 100μl 終止反應(yīng)。 陽性對(duì)照應(yīng)為陽性，且吸光度值應(yīng)不低于 。 (2)試驗(yàn)中所有試劑及吸頭均需滅菌。