【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 目鏡測(cè)微尺格數(shù) 實(shí)際長(zhǎng)度 目鏡測(cè)微尺格數(shù) 實(shí)際直徑／／出) 寬 長(zhǎng) 寬 長(zhǎng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 均值試與已知的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的大小作一比較是否一致?為何? 七、問(wèn)題和思考 1。為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)必須重新用鏡臺(tái)測(cè)微尺對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行標(biāo)定? 2。若目鏡不變，目鏡測(cè)微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測(cè)微尺每格所測(cè)量的鏡臺(tái)上的菌體細(xì)胞的實(shí)際長(zhǎng)度(或?qū)挾?是否相同?為什么?實(shí)驗(yàn)九 細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定（血球板計(jì)數(shù)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：掌握細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法和綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)探究。 內(nèi)容：1．計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù)。 2．載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù)。 3．平板菌落計(jì)數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)斜面培養(yǎng)物(約培養(yǎng)l0h)、培養(yǎng)5～7d的大腸桿菌(E．coli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、美藍(lán)染色液、結(jié)晶紫染色液、香柏油、二甲苯、無(wú)菌水。 顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、酒精燈、無(wú)菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無(wú)菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡低、無(wú)菌試管、涂布器、無(wú)菌培養(yǎng)皿。三、操作步驟(一)計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù) 1．血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由四條平行槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)，中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺(tái)面各有一個(gè)含9個(gè)大格的方格網(wǎng)，中間大格為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的長(zhǎng)和寬各為lmm，中間平臺(tái)下陷0．1mm，故蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的容積為0．1mm3。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造見(jiàn)圖16。常見(jiàn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格。一種是16X 25型，稱(chēng)為麥?zhǔn)涎?xì)胞計(jì)數(shù)板，共有16個(gè)中格，每個(gè)中格分為25個(gè)小格。另一種是25X16型，稱(chēng)為希里格式血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，共有25個(gè)中格，每個(gè)中格又分成16個(gè)小格。但是不管哪種規(guī)格的血細(xì)胞計(jì)板其計(jì)數(shù)室的小格均由400個(gè)小方格組成。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)算微生物細(xì)胞的數(shù)量，方法是先測(cè)定若干個(gè)方格中的微生物細(xì)胞，再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細(xì)胞數(shù)量。 2．細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定 (1)稀釋加樣；取枯草芽孢桿菌斜面少量菌體至100mL無(wú)菌水中，稀釋混勻后待用(濃度約為104～105／mL)。先將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取以上稀釋液滴于蓋玻片的邊緣，讓菌液自行滲入，多余菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待細(xì)菌細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部，將計(jì)數(shù)板放于載物臺(tái)的中央，按下列步驟尋找計(jì)數(shù)室并計(jì)數(shù)。 (2)找計(jì)數(shù)室：先在低倍鏡下尋找計(jì)數(shù)板大方格網(wǎng)的位置，轉(zhuǎn)換高倍鏡后，調(diào)節(jié)光亮度至菌體和計(jì)數(shù)室線條清晰為止，再將計(jì)數(shù)室一角的小格移至視野中。順著大方格線移動(dòng)計(jì)數(shù)板，使計(jì)數(shù)室位于視野中間。 (3)計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)時(shí)，如用16X25型計(jì)數(shù)板則按對(duì)角線方位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)大格(共4個(gè)大格，100個(gè)小格)內(nèi)的細(xì)胞逐一進(jìn)行計(jì)數(shù)；如使用規(guī)格為25X16型的計(jì)數(shù)板，則除取左上、右上、左下、右下4個(gè)大格外，還需加中央的一個(gè)大格(共5個(gè)中格，80個(gè)小格)內(nèi)的細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)當(dāng)遇到大格線上的細(xì)菌時(shí)，一般只計(jì)此大格的上方及右方線上的細(xì)胞(或只計(jì)下方及左方線上的細(xì)胞)，將計(jì)得的細(xì)胞數(shù)填入結(jié)果表中，對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值，按下列公式計(jì)算每mL菌液中所含的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。16X25和25X16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)算公式(二)載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù) 1．搖動(dòng)菌液使其混合均勻，用無(wú)菌微量移液管取菌液0．01mL于載玻片上，并用無(wú)菌接種環(huán)均勻地涂布在1cm2的面積上。風(fēng)干，固定，結(jié)晶紫染色1min，沖洗，干燥備用。 2．用物鏡測(cè)微尺，測(cè)量顯微鏡油鏡觀察時(shí)的視野直徑，并以S=лr2公式，計(jì)算出視野面積。 3．將涂片置于載物臺(tái)，滴香柏油，以油鏡觀察，不斷變化視野，共觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每一視野中細(xì)菌個(gè)數(shù)。以下列公式計(jì)算每毫升菌液中的含菌數(shù)量。(三)平板菌落計(jì)數(shù) 另取滅菌移液管吸取上述枯草芽孢桿菌稀釋液lmL，放人已滅菌的培養(yǎng)皿中，再倒人融化而冷卻到5012左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基同時(shí)制作3個(gè)平板，皿中鋪成一薄層，并使乎皿作前后和左右滑動(dòng)，使樣品和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后倒置，37C培養(yǎng)24h后計(jì)算菌落數(shù)，并計(jì)算其每mL的含菌量。 四、注意事項(xiàng) 直接鏡檢計(jì)數(shù)完畢，用蒸餾水沖洗計(jì)數(shù)板。絕不能用硬物洗刷。洗后待其自行晾干，或用濾紙沾干。最后用擦鏡紙擦干凈。若計(jì)數(shù)是病原微生物，則需先浸泡在5％的石炭酸溶液中進(jìn)行消毒，然后再進(jìn)行清洗。五、演示 1．顯微鏡下顯示計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室。 2．平板菌落計(jì)數(shù)操作過(guò)程。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 (一)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果1． 計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù)結(jié)果：計(jì)算次數(shù) 各大格中細(xì)胞數(shù)大格中細(xì)胞總數(shù)稀釋倍數(shù)總菌數(shù)/個(gè)*mL1或個(gè)*g1左上右上右下左下中間 第一次 第二次 第三次 平均值2．涂片直接鏡檢計(jì)數(shù)結(jié)果 視野12345678910 平均視野 待測(cè)樣品/ml*g1 菌數(shù)3．平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果： 總菌數(shù)/個(gè)mL1或g1=每皿平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù) (二)比較以上3種不同計(jì)數(shù)方法所得的結(jié)果并進(jìn)行分析。 七、問(wèn)題和思考 1．根據(jù)你的體會(huì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算的誤差主要來(lái)自哪些方面?應(yīng)如何減少誤差? 2．比較各種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 3。設(shè)計(jì)一個(gè)方案，如何計(jì)數(shù)市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的單位含菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)十 培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)習(xí)和掌握配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟內(nèi)容：牛肉膏蛋白胨的配制高氏1號(hào)培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基的配制二、實(shí)驗(yàn)材料和用具牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNONaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線繩、紗布三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普遍的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15~20g，水1000ml，~稱(chēng)藥品 按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱(chēng)取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶解后倒入大燒杯，牛肉膏極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過(guò)程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失水分。調(diào)pH 檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/l HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。PH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不可調(diào)過(guò)頭，以免調(diào)回影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度過(guò)濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可以省略。分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法如圖1—1。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、日期。滅菌 ℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜面，使斜面的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的1/2。無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24~48h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用?；騼?chǔ)存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。（二）高氏一號(hào)培養(yǎng)基的配制高氏一號(hào)培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g、NaCl 、K2HPO4*3H2O 、MgSO4*、 FeSO4*7H2O ，瓊脂15~20g,水1000ml，~。稱(chēng)量和溶解 先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加入至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO4*7H2O可先配制成高濃度的儲(chǔ)備液再加入，方法是先在100ml中加入1g的FeSO4*7H2O，再在1000ml培養(yǎng)基中加入以上儲(chǔ)備液1ml即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：K2HPO41g、MgSO4*，蛋白胨5g，瓊脂15~20g，水1000ml，自然pH。稱(chēng)量和溶解 先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取各成分，并將其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制鏈霉素的加入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降低至45℃左右時(shí)才能加入。可先將鏈霉素配成1%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于零下20℃），在100ml培養(yǎng)基中加1%，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30ug。四、注意事項(xiàng)稱(chēng)藥品用的牛角匙不能混用；稱(chēng)完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、演示培養(yǎng)基的分裝方法試管斜面的擱置方法六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱(chēng)、數(shù)量，并圖解說(shuō)明其配制過(guò)程，指明要點(diǎn)。七、問(wèn)題與思考配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟？在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題？為什么？培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌？若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無(wú)菌檢查？試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn)十一 消毒與滅菌一,干熱滅菌 (一)目的要求 . . (二)基本原理 ,在菌體受熱時(shí),當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大,則蛋白蛋凝固就越快,反之含水量越少,與濕熱滅菌相比,干熱滅菌所需溫度要高(160～170℃),時(shí)間要長(zhǎng)(1～2h),但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180℃,否則,包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦,. 圖21 電烘箱的外觀和結(jié)構(gòu) 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 12. 保溫室。 。 14. 散熱板。 (三)器材 培養(yǎng)皿,試管,吸管,電烘箱等. (四)操作步驟 將包好的待滅菌物品(培養(yǎng)皿,試管,吸管等)放入電烘箱內(nèi),關(guān)好箱門(mén). 物品不要擺得太擠,以免妨礙空氣流通,滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板,以防包裝紙烤焦起火. 接通電源,撥動(dòng)開(kāi)關(guān),打開(kāi)電烘箱排氣孔,旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至綠燈亮,℃時(shí),如果紅燈熄滅,綠燈亮,表示箱內(nèi)停止加溫,此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160—170℃溫度,則需轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)器使紅燈再亮,如此反復(fù)調(diào)節(jié),直至達(dá)到所需溫度. 當(dāng)溫度升達(dá)到160～170℃時(shí),恒溫調(diào)節(jié)器會(huì)自動(dòng)控制調(diào)節(jié)溫度,保持此溫度2h. . 切斷電源,自然降溫. 待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后,打開(kāi)箱門(mén),取出滅菌物品. 電烘箱內(nèi)溫度末降到70℃,切勿自行打開(kāi)箱門(mén)以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂. (五)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 思考題 ,為什么 ,時(shí)間要長(zhǎng) 請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較實(shí)驗(yàn)方案. 二 高壓蒸氣滅菌 (一)目的要求 . . (二)基本原理 高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi),通過(guò)加熱,然后關(guān)閉排氣閥,繼續(xù)加熱,此時(shí)由于蒸氣不能溢出,而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力,從而使沸點(diǎn)增高,得到高于100℃. 在同一溫度下,:一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分,蛋白質(zhì)較易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低(表2—1),二是濕熱的穿透力比干熱大,℃時(shí),(千焦),能迅速提高被滅菌物體的溫度,從而增加