序列測(cè)定的技術(shù)和策略(編輯修改稿)
2025-08-31 16:19 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 dNTP 直至幾年以前，實(shí)際上所有DNA測(cè)序反應(yīng)都用[α－32P]dNTP來(lái)進(jìn)行。然而32P發(fā)射的強(qiáng)β粒子造成兩個(gè)問(wèn)題。首先由于發(fā)生散射，放射自顯影片上的條帶遠(yuǎn)比凝膠上的DNA條帶更寬、更為擴(kuò)散，因此將影響到所讀取的序列（尤其是從放射自顯影片的上部所讀取的序列）的正確性并將制約從單一凝膠上能讀出的核苷酸序列的長(zhǎng)度。其次32P的衰變會(huì)引起樣品中DNA的輻射分解，因此用32P進(jìn)行標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)只能保存一兩天，否則DNA將被嚴(yán)重破壞以至測(cè)序凝膠上模糊不清、真假莫辨。[35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大緩解了上述兩方面的矛盾。由于35S衰變產(chǎn)生較弱的β粒子，其散射有所減弱，凝膠和放射自顯影片之間在分辨率上相差無(wú)幾，因此可以從一套反應(yīng)中確切測(cè)定數(shù)百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能輻射所引起的樣品分解比較輕微，因此，測(cè)序反應(yīng)可在－20℃保存至1周，而分辨率不見下降。這樣，職果聚丙烯酰胺凝膠方面了發(fā)生技術(shù)故障，只要對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行重分析即可。５．dNTP類似物 二重對(duì)稱的DNA區(qū)段（特別是GC含量高者）可以形成鏈內(nèi)二級(jí)過(guò)程中不能充分變性。因此將引起不規(guī)則遷移，使鄰近的DNA條帶壓縮在一起，以致難以讀出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在，而且不可能通過(guò)改變測(cè)序反應(yīng)中出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)地存在，而且不可能通過(guò)改變測(cè)序反應(yīng)中所用DNA聚合酶的種類而得到減輕。但是凝膠中的壓縮區(qū)段往往可以通過(guò)采用諸如dITP（239。－脫氧次黃苷1539。 －三磷酸）或7－脫氮－dGTP（7－脫氮－239。－脫氧鳥苷－539。 －三磷酸）等核苷酸類似物進(jìn)行分辨。這些類似物與普通堿基的配對(duì)能力較弱，而且是測(cè)序酶和Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶的合適底物（Gough和Murray，1983。Mixusawa等，1986。Innis等，1988）。但對(duì)某些壓縮條帶，7－脫氮－dGTP無(wú)濟(jì)于事；同樣，dITP也無(wú)補(bǔ)于另一壓縮條帶（尤其是得于GC豐富區(qū)的縮條帶）的分辨。如果需要采用類似物，首先可試用dOTP，如果壓縮條帶用d ITP或7－脫氮－dGTP都無(wú)法分辨， 則轉(zhuǎn)而測(cè)定另一條鏈的DNA序列幾乎總能如愿以償。如上所述，兩種形式的測(cè)序酶和Taq DNA聚合酶對(duì)核苷酸類似物的耐受性優(yōu)于大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造廠商聲稱在測(cè)定含穩(wěn)固二結(jié)構(gòu)的模板序列時(shí)。，其作用總是一氣呵成，很少半途而廢，因而消除了“鬼”帶。 而且。 二、Maxam－Gilbert DNA化學(xué)降解法 與包括合成反應(yīng)的鏈終止技術(shù)不同，MaxamGilbert法要對(duì)原DNA進(jìn)行化學(xué)降解。這一方法是在體外研究lac阻抑制與lac操縱基因相互作用時(shí)醞釀發(fā)展起來(lái)的。時(shí)至今日，可以探測(cè)DNA構(gòu)象的蛋白質(zhì)－DNA相到作用，仍然是Maxam Gilbert法獨(dú)具的鮮明特點(diǎn)。在這一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在5組互相獨(dú)立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某于種或某一類堿基。因此生成5組放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。相對(duì)而言，MaxamGilbert法自初次提出以來(lái)，基本沒有變化。雖然設(shè)計(jì)了另一些化學(xué)降解反應(yīng)（見綜述：Ambrose和Pless，1987），但這些反應(yīng)一般只作為Maxam和Gilbert(1977，1980)最早提出的反應(yīng)的補(bǔ)充。這一方法的成敗，完全取決于上述這些佞兩步進(jìn)行的降解反應(yīng)的特異性。第一步先對(duì)特定堿基（或特定類型的堿基）進(jìn)行化學(xué)修飾，而第二步修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基539。和339。的磷酸二酯鏈斷裂。在每種情況下，這些反應(yīng)都要在精心控制的條件下進(jìn)行，以確保每一個(gè)DNA分子平均只有一個(gè)靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的539。和339。位置，得到一組長(zhǎng)度從一到數(shù)百個(gè)核苷酸不等的末端標(biāo)記分子。比較G、A＋G、C＋T、C和AC各個(gè)泳道， 右從測(cè)序凝膠的放射自顯影片上讀出DNA序列。由于種種原因（如采用32P進(jìn)行放射性標(biāo)記、末端標(biāo)記DNA的比活度、裂解位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布、凝膠技術(shù)方面的局限性等等），MaxamGilber法所能測(cè)定的長(zhǎng)充要比Sanger法短一些，它對(duì)放射性標(biāo)記末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。在70年代Maxa
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