序列測定的技術和策略(編輯修改稿)
2025-08-31 16:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 dNTP 直至幾年以前，實際上所有DNA測序反應都用[α－32P]dNTP來進行。然而32P發(fā)射的強β粒子造成兩個問題。首先由于發(fā)生散射，放射自顯影片上的條帶遠比凝膠上的DNA條帶更寬、更為擴散，因此將影響到所讀取的序列（尤其是從放射自顯影片的上部所讀取的序列）的正確性并將制約從單一凝膠上能讀出的核苷酸序列的長度。其次32P的衰變會引起樣品中DNA的輻射分解，因此用32P進行標記的測序反應只能保存一兩天，否則DNA將被嚴重破壞以至測序凝膠上模糊不清、真假莫辨。[35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大緩解了上述兩方面的矛盾。由于35S衰變產(chǎn)生較弱的β粒子，其散射有所減弱，凝膠和放射自顯影片之間在分辨率上相差無幾，因此可以從一套反應中確切測定數(shù)百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能輻射所引起的樣品分解比較輕微，因此，測序反應可在－20℃保存至1周，而分辨率不見下降。這樣，職果聚丙烯酰胺凝膠方面了發(fā)生技術故障，只要對測序反應進行重分析即可。５．dNTP類似物 二重對稱的DNA區(qū)段（特別是GC含量高者）可以形成鏈內(nèi)二級過程中不能充分變性。因此將引起不規(guī)則遷移，使鄰近的DNA條帶壓縮在一起，以致難以讀出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級結(jié)構的存在，而且不可能通過改變測序反應中出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級結(jié)構地存在，而且不可能通過改變測序反應中所用DNA聚合酶的種類而得到減輕。但是凝膠中的壓縮區(qū)段往往可以通過采用諸如dITP（239。－脫氧次黃苷1539。 －三磷酸）或7－脫氮－dGTP（7－脫氮－239。－脫氧鳥苷－539。 －三磷酸）等核苷酸類似物進行分辨。這些類似物與普通堿基的配對能力較弱，而且是測序酶和Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶的合適底物（Gough和Murray，1983。Mixusawa等，1986。Innis等，1988）。但對某些壓縮條帶，7－脫氮－dGTP無濟于事；同樣，dITP也無補于另一壓縮條帶（尤其是得于GC豐富區(qū)的縮條帶）的分辨。如果需要采用類似物，首先可試用dOTP，如果壓縮條帶用d ITP或7－脫氮－dGTP都無法分辨， 則轉(zhuǎn)而測定另一條鏈的DNA序列幾乎總能如愿以償。如上所述，兩種形式的測序酶和Taq DNA聚合酶對核苷酸類似物的耐受性優(yōu)于大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造廠商聲稱在測定含穩(wěn)固二結(jié)構的模板序列時。，其作用總是一氣呵成，很少半途而廢，因而消除了“鬼”帶。 而且。 二、Maxam－Gilbert DNA化學降解法 與包括合成反應的鏈終止技術不同，MaxamGilbert法要對原DNA進行化學降解。這一方法是在體外研究lac阻抑制與lac操縱基因相互作用時醞釀發(fā)展起來的。時至今日，可以探測DNA構象的蛋白質(zhì)－DNA相到作用，仍然是Maxam Gilbert法獨具的鮮明特點。在這一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一個末端標記的DNA片段在5組互相獨立的的化學反應分別得到部分降解，其中每一組反應特異地針對某于種或某一類堿基。因此生成5組放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。相對而言，MaxamGilbert法自初次提出以來，基本沒有變化。雖然設計了另一些化學降解反應（見綜述：Ambrose和Pless，1987），但這些反應一般只作為Maxam和Gilbert(1977，1980)最早提出的反應的補充。這一方法的成敗，完全取決于上述這些佞兩步進行的降解反應的特異性。第一步先對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學修飾，而第二步修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基539。和339。的磷酸二酯鏈斷裂。在每種情況下，這些反應都要在精心控制的條件下進行，以確保每一個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的539。和339。位置，得到一組長度從一到數(shù)百個核苷酸不等的末端標記分子。比較G、A＋G、C＋T、C和AC各個泳道， 右從測序凝膠的放射自顯影片上讀出DNA序列。由于種種原因（如采用32P進行放射性標記、末端標記DNA的比活度、裂解位點的統(tǒng)計學分布、凝膠技術方面的局限性等等），MaxamGilber法所能測定的長充要比Sanger法短一些，它對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。在70年代Maxa
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