【文章內(nèi)容簡介】 UCE)顯著提高。與一般啟動(dòng)子相比，這兩個(gè)區(qū)域都有不尋常的組成，富含GC堿基對，而且它們約有 85%是一致的。RNA 聚合酶Ⅰ需要兩個(gè)輔助因子。上游元件結(jié)合因子(UBF1)是一個(gè)單鏈多肽，它先與UCE 結(jié)合，再與核心啟動(dòng)子。選擇因子（SL1）由 4 種蛋白質(zhì)組成，其行為類似細(xì)菌的σ因子，它不與啟動(dòng)子特異性地結(jié)合，但可以與和啟動(dòng)子特異結(jié)合的其它成分相結(jié)合，其主要功能是使 RNA 聚合酶正確的定位在起始位點(diǎn)。一旦 UBF1 結(jié)合，SL1 就可以協(xié)同結(jié)合到相應(yīng)的 DNA 區(qū)域。兩個(gè)因子都結(jié)合后， RNA 聚合酶Ⅰ就與核心啟動(dòng)子結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄。8.@ RNA聚合酶III識別的啟動(dòng)子有哪幾類？其定位因子是什么？（1）RNA聚合酶Ⅲ，位于核質(zhì)內(nèi)，負(fù)責(zé)合成 tRNA和小 RNA。5S RNA和tRNA基因的啟動(dòng)子是內(nèi)部啟動(dòng)子，它們位于起位點(diǎn)下游。snRNA(核小 RNA)基因的啟動(dòng)子與其它啟動(dòng)子相似，位于起始位點(diǎn)上游。這兩種情況中，啟動(dòng)子的功能元件都是由可被轉(zhuǎn)錄因子識別的序列組成，但它反過來指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合。（2）RNA 聚合酶Ⅲ有三種類型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)，包括兩種類型的內(nèi)部啟動(dòng)子（類型 I和類型 II），每個(gè)都含有兩個(gè)分開的結(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)短序列元件被一個(gè)多變的序列分開。類型 I由boxA序列和一個(gè)隔開的 boxC序列組成，類型 II由 boxA和一個(gè)隔開的 boxB序列組成。類型 II啟動(dòng)子上的 A盒和 B 盒之間的距離可以變化很大，但兩盒不能過近，太近會失去其功能。我們將在稍后討論其上游類型的組織結(jié)構(gòu)。第 III 類啟動(dòng)子，其被分隔的啟動(dòng)子序列在起始位點(diǎn)上游，有三個(gè)上游元件:Oct—PSE—TATA。RNA 聚合酶Ⅲ在上游啟動(dòng)子的起始可在緊靠起始位點(diǎn)上游的一段短區(qū)域內(nèi)發(fā)生，而且該區(qū)域只包含 TATA元件。然而，如果具有 PSE(近端序列元件)和 OCT元件，轉(zhuǎn)錄的效率會大大提高。這些元件的結(jié)合因子能夠起互相協(xié)調(diào)作用。（3）RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的輔助因子在 RNA聚合酶之前先與啟動(dòng)子結(jié)合。它們形成前起始復(fù)合體指導(dǎo) RNA聚合酶結(jié)合。RNA聚合酶 III 通過內(nèi)部啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄過程中，包含著 TFIIIA、TFIIIC、TFIIIB 以及聚合酶的依次組裝。TFⅢA和TFⅢC是裝配因子，其作用是幫助TFⅢB結(jié)合在正確的位置。TFⅢB 是 RNA 聚合酶Ⅲ所需要的真正的起始因子，負(fù)責(zé) RNA聚合酶的正確定位。在類型 I啟動(dòng)子，TFⅢA結(jié)合一個(gè)包括 boxC的序列，而且該結(jié)合是 TFⅢC 結(jié)合所需要的，TFⅢC 的結(jié)合又引發(fā) TFⅢB 與起始位點(diǎn)周圍的一個(gè)序列結(jié)合。在類型 II 啟動(dòng)子，TFⅢC 識別 boxB，但結(jié)合在一個(gè)更大的區(qū)域包括 boxA 和boxB，然后招募TFⅢB結(jié)合。對于上游啟動(dòng)子的第 III 類啟動(dòng)子，TATA元件被一個(gè)包含 TBP的因子識別，多種轉(zhuǎn)錄因子直接識別上游位點(diǎn)形成前起始復(fù)合體(包括 TBP)，此復(fù)合體被 RNA 聚合酶Ⅲ所識別。9.@RNA聚合酶II識別的啟動(dòng)子含有多種順式作用因子，請舉4例。RNA 聚合酶Ⅱ，位于核質(zhì)內(nèi)(細(xì)胞核的一部分，不包括核仁)，負(fù)責(zé)合成核不均一 RNA(hnRNA)，即 mRNA的前體。真核 RNA 聚合酶 II 啟動(dòng)子包含著多種順式作用因子：基本元件TATA 盒，上游元件（如CAAT 盒、GC 盒，八聚體）以及其他序列元件之間的不同組合。在任何一個(gè)啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的這些元件在數(shù)目上和位置排列方向不同。（1）TATA盒(集中在30bp)是啟動(dòng)子最小的成分，對核心啟動(dòng)子的定位有決定性作用。盡管當(dāng) TATA 盒突變，起始不受阻止，但是起始位點(diǎn)和它通常的精確位置不同。（2）。CAAT 盒能被多種因子識別，比如說，CAAT 盒能和 CTF 家族中的多種因子相互作用。不同啟動(dòng)子中的 CAAT盒被不同的因子識別。CAAT 盒影響起始效率，GC和 CAAT盒好像在兩個(gè)方向上都能發(fā)揮作用，但似乎對啟動(dòng)子的特異性沒有直接作用，它的存在加強(qiáng)了啟動(dòng)子的強(qiáng)度。上游序列元件，很可能通過直接和通用轉(zhuǎn)錄因子作用來強(qiáng)化裝配成一個(gè)起始復(fù)合體的效率。（3）GC 盒通常在起始位點(diǎn)上游 4070bp 處，GC 盒可被 SP1因子識別。GC 盒也好像在兩個(gè)方向上都能發(fā)揮作用，影響起始效率（4）八聚體序列也能被多種因子識別，能增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。10.@如何實(shí)現(xiàn)真核生物一蛋白基因在大腸桿菌細(xì)胞中受控、穩(wěn)定、分泌和高效表達(dá)。答 大腸桿菌是高效表達(dá)異源蛋白最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。由于每種基因都有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質(zhì)折疊的難易程度，修主細(xì)胞蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解等等原因，因此并非每一種基因都能在大腸桿菌中有效表達(dá)。下面淺談一下實(shí)現(xiàn)真核生物一蛋白基因在大腸桿菌細(xì)胞中受控、穩(wěn)定、分泌和高效表達(dá)的策略。首先，要構(gòu)建有效的表達(dá)載體，一種高效的原核表達(dá)載體需要包括一個(gè)強(qiáng)大并且可以嚴(yán)緊調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子；一位于翻譯起始密碼子5’端大約9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一個(gè)高效轉(zhuǎn)錄終止子。除此之外，載體還需要一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，篩選標(biāo)記和利于對啟動(dòng)子活性進(jìn)行嚴(yán)緊調(diào)節(jié)的基因。這種調(diào)節(jié)元件可以插入載體自身，也可以插入宿主的染色體。其他的元件包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)子等。這些元件的作用往往具有基因特異性，因此要根據(jù)不同的情況加以取舍。構(gòu)建表達(dá)載體，需要仔細(xì)考慮多種元件的組合，以保證最高水平的蛋白質(zhì)合成。a，提高轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的策略， （1）選擇的啟動(dòng)子要具有適合高水平蛋白質(zhì)合成的某些特性。首先啟動(dòng)子的作用要強(qiáng)；第二，它必須表現(xiàn)最低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性。若要求高效的基因表達(dá)，最好選用高密度培養(yǎng)細(xì)胞和表現(xiàn)最低活性的可誘導(dǎo)和非抑制啟動(dòng)子。（2），有可能利用增強(qiáng)子來達(dá)到超量表達(dá)蛋白質(zhì)的目的（3）雖然轉(zhuǎn)錄終止子在表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程中常被忽略，但有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達(dá)載體必不可少的元件。b，提高翻譯水平調(diào)控的策略 （1）mRNA5’末端的獨(dú)特結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯起始效率的最主要決定因素，因此找到通用的有效起始翻譯的共同序列能高效起始外源蛋白的翻譯。（2）SD與起始密碼子間的距離約為513bp，這一距離影響翻譯起始的效率，因此在設(shè)計(jì)載體中要控制好這段距離。（3）在mRNA的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)在決定基因表達(dá)效率方面具有重要作用，使用一些策略使mRNA形成二級結(jié)構(gòu)的可能性最小。（3）mRNA的快速降解勢必影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，比如可以通過選用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌來提高基因的表達(dá)。（4）在mRNA中存在終止信號是翻譯終止過程必不可少的，在設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)，通常插入三個(gè)終止密碼子以防止核糖體的跳躍。C,（1）將蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基（2）在較低的溫度下培養(yǎng)細(xì)菌；（3）選用蛋白酶缺陷的菌株；（4）構(gòu)建N末端或C末端融合蛋白；融合系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量的可溶性的融合蛋白。（5）將目的基因多拷貝串聯(lián)；（6）與分子伴侶共表達(dá)（7）替換特定的氨基酸殘基以消除蛋白酶裂解位點(diǎn)；（8）改善蛋白質(zhì)的親水性；（9）優(yōu)化培養(yǎng)條件，D,提高真核生物蛋白基因在大腸桿菌細(xì)胞分泌的策略 （1）將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外是人們最期望的一種策略。因?yàn)檫@樣容易純化目的蛋白質(zhì)，減少細(xì)菌的蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的裂解。但是。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，金黃色葡萄球菌A蛋白的信號肽能引導(dǎo)帶有E結(jié)構(gòu)域的A蛋白片段或融合產(chǎn)物從細(xì)胞質(zhì)外泌到培養(yǎng)基中，如果能利用可控的強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行A蛋白信號肽引導(dǎo)的基因表達(dá)，則有望在蛋白質(zhì)外泌方面有所突破。（2）對培養(yǎng)基的特殊操作能明顯提高蛋白質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中。例如，在培養(yǎng)基中添加甘氨酸能增強(qiáng)外周質(zhì)蛋白釋放到培養(yǎng)基中，且不引起明顯的細(xì)菌裂解。11.@請闡述ALTERNATIVE SPLICING的生理學(xué)意義。選擇性剪接是指同一基因轉(zhuǎn)錄形成的初級RNA經(jīng)過不同的剪切和連接方式形成不同的mRNA的過程。是mRNA前體加工過程中一個(gè)重要的調(diào)控機(jī)制，它使得可在低遺傳值條件下產(chǎn)生高度的蛋白質(zhì)多樣性。真核生物