【文章內(nèi)容簡介】 、多西紫杉()、異環(huán)磷酰胺()、替尼泊甙()、拓樸替康()、雌莫司汀()?！鴥?nèi)外專家認(rèn)為，中國人品眾多，近幾年來癌癥發(fā)病率持續(xù)上升，“十五”期間，中國國內(nèi)的抗癌藥市場(chǎng)無疑將具有驚人的發(fā)展?jié)摿?。國?nèi)臨床上治療急需的新型抗腫瘤藥物，尤其是發(fā)病率高的胃癌(％)、肝癌(％)、肺癌(％)、食管癌(％)等治療藥物將成為醫(yī)藥市場(chǎng)上增長的新熱點(diǎn)。目前對(duì)急性白血病的治療還沒有理想的藥物，有待進(jìn)一步研究開發(fā)。故研制和生產(chǎn)新型抗腫瘤藥物特別是新型天然類抗腫瘤藥物具有廣闊的市場(chǎng)前景。第三章 建設(shè)規(guī)模及產(chǎn)品方案 生產(chǎn)裝置規(guī)模及產(chǎn)品方案根據(jù)以上國內(nèi)外消費(fèi)市場(chǎng)和生產(chǎn)狀況分析，確定本項(xiàng)目的生產(chǎn)裝置規(guī)模為年生產(chǎn)重組腫瘤壞死因子NC（rhTNFNC）100萬支。項(xiàng)目總投資3億元總占地面積300畝 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)此項(xiàng)目產(chǎn)品技術(shù)含量高，生產(chǎn)工藝先進(jìn)，系國家一類生物制品，是國內(nèi)急需的治療腫瘤的有效藥物。rhTNFNC具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，尤其是它具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而對(duì)正常細(xì)胞則無殺傷作用，使得腫瘤壞死因子有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。由于原型腫瘤壞死因子抗腫瘤活性較低，毒性反應(yīng)較大，限制了其臨床應(yīng)用。針對(duì)這一點(diǎn)，我們應(yīng)用了基因工程重組技術(shù)，對(duì)原型TNF分子進(jìn)行了定向改造，使其抗腫瘤活性提高了100倍，而毒性反應(yīng)只有原來的十分之一。rhTNFNC投放市場(chǎng)，將會(huì)給腫瘤患者帶來福音，減少其治療過程中巨大的痛苦，延長生存時(shí)間。腫瘤壞死因子NC(rhTNFNC)作為新生物制品一類新藥，是國家重點(diǎn)扶持項(xiàng)目之一，已完成了臨床前和I、 II、 III期臨床試驗(yàn)，基本達(dá)到了可獲得I類和一線抗腫瘤藥物新藥證書和進(jìn)入試生產(chǎn)的條件。腫瘤壞死因子NC(rhTNFNC)臨床研究與試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，不需預(yù)防用藥以克服其不良反應(yīng)，無論在療效、副作用等方面與目前同類抗腫瘤藥物相比，要好得多，臨床作用是安全的。計(jì)劃每支零售為350元/支。(1)項(xiàng)目的土建施工主要由鄒平福海園區(qū)發(fā)展有限公司全權(quán)負(fù)責(zé)。為了充分做好項(xiàng)目的規(guī)劃設(shè)計(jì)、報(bào)批、技術(shù)準(zhǔn)備等前期工作，公司成立由主要領(lǐng)導(dǎo)牽頭的項(xiàng)目建設(shè)指揮部，配合生物科技園區(qū)發(fā)展有限公司做好項(xiàng)目的論證、建筑設(shè)計(jì)、施工監(jiān)督等工作，充分研究基地的建設(shè)規(guī)劃、圖紙?jiān)O(shè)計(jì)、水電暖等配套工作。(2)項(xiàng)目將嚴(yán)格按照國家有關(guān)要求，嚴(yán)格實(shí)行項(xiàng)目建設(shè)指揮部指揮長負(fù)責(zé)制、招投標(biāo)制和工程監(jiān)理制。對(duì)設(shè)計(jì)院所、建筑公司、監(jiān)理公司的選擇，儀器設(shè)備和建筑原材料的選購均按照投標(biāo)方式進(jìn)行。第四章 工藝技術(shù)方案 材料　質(zhì)粒、菌株和藍(lán)藻細(xì)胞株　大腸桿菌Escherichia coli TG1，質(zhì)粒pRLrhTNF來自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院；質(zhì)粒pRL439, RP4+ ；魚腥藻7120（Anabaena sp. PCC7120 ）來自法國巴斯德研究所。　　工具酶和試劑　　各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、隨機(jī)引物試劑盒和DNA聚合酶大片段（Klenow）均為Promega公司產(chǎn)品，同位素α32PdCTP來自福瑞公司，鼠抗人TNFα單克隆抗體為北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司產(chǎn)品。　方 法　藍(lán)藻的培養(yǎng)　魚腥藻7120的培養(yǎng)在BG11［11］無氮培養(yǎng)基中，溫度28～30℃，于光強(qiáng)120～150 μmol/，液體培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為130r/min.　重組DNA技術(shù)　　質(zhì)粒的提取、酶切、片段回收、末端修飾、連接、轉(zhuǎn)化、及瓊脂糖凝膠電泳方法均參見國際通用方法?！≠|(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分析　　質(zhì)粒pRLrhTNF表達(dá)的熱誘導(dǎo)：接種單菌落入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜.　3%接種量轉(zhuǎn)移過夜培養(yǎng)物到新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)30℃培養(yǎng)至A600=～,立即轉(zhuǎn)入42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)5～6 h。SDSPAGE：收集菌體，裂解變性后走SDSPAGE（12％分離膠），經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后用CS930掃描儀（日本）檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)水平?！∪H接合轉(zhuǎn)移　　 (1) 大腸桿菌的準(zhǔn)備：三親接合轉(zhuǎn)移前一天晚上，在含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，分別接種含穿梭表達(dá)載體質(zhì)粒及含接合質(zhì)粒（RP4）和輔助質(zhì)粒（pRL542）的HB101菌，振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集后重懸于一定體積的BG11培養(yǎng)基中； （2）藍(lán)藻的準(zhǔn)備：三親接合轉(zhuǎn)移前更換培養(yǎng)液，繼續(xù)照光培養(yǎng)一定時(shí)間后，離心收集藻細(xì)胞，洗滌后重懸于一定體積的BG11中并做系列稀釋；(3) 三親接合轉(zhuǎn)移：將細(xì)菌和藻混合后涂于混合纖維素酯微孔濾膜（φ50， μm，華美公司）上，在不含抗生素的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d后,連膜轉(zhuǎn)移至含新霉素的BG11培養(yǎng)基上繼續(xù)照光培養(yǎng),直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)?！∷{(lán)藻質(zhì)粒的提取　　探針的標(biāo)記和純化　　采用隨機(jī)引物標(biāo)記系統(tǒng)（PrimerAgene system, Promega）,檢測(cè)TNFα基因在藍(lán)藻細(xì)胞中的存在所用探針為質(zhì)粒pRLrhTNF的XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)生的700 bp DNA片段.　探針DNA變性后，在Klenow酶（5U）作用下?lián)饺毽?2PdCTP（50 μCi），標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后的DNA樣品過Sephadex G50柱層析純化后，收集標(biāo)記的探針峰用于Southern印跡?！outhern印跡　　DNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳分離后,經(jīng)變性和中和后轉(zhuǎn)移至Zeta probe尼龍膜（華美, μm）上,將膜于80℃烘烤2 h后,加入預(yù)雜交液過夜后,換含放射性探針的雜交液于42℃雜交24 h. 雜交之后的膜在2SSC，% SDS溶液中室溫洗2次，每次30 min。 SSC，% SDS溶液于55℃洗膜2次，每次45 min，于70℃放置自顯影?！　estern印跡　TNFα基因在魚腥藻7120中表達(dá)后,破碎細(xì)胞，細(xì)胞裂解液變性后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜后，用適當(dāng)?shù)木彌_液洗膜，加抗血清于37℃結(jié)合2～3 h，經(jīng)過適當(dāng)緩沖液洗膜后，加羊抗鼠酶標(biāo)二抗進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，洗膜后進(jìn)行顯色觀察?！∞D(zhuǎn)基因藍(lán)藻中TNF的表達(dá)和活性測(cè)定　轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120在含新霉素25 μg/mL (Neo25)的無氮BG11固體培養(yǎng)基［11］平板上保種，挑單藻落在同樣的液體培養(yǎng)基中通氣擴(kuò)大培養(yǎng)，光強(qiáng)120～150 μmol/（日光燈下），溫度28～30℃.　對(duì)數(shù)生長中后期離心收藻（4℃，6 000 r/min，15 min）， mmol/L TrisHCl （buffer A）洗滌沉淀2次.　按每克鮮藻加3 mL裂解緩沖液（buffer A, 1 mmol/L EDTA, mol/L NaCl）懸浮沉淀，用液氮凍融3次，冰水浴中加玻璃微珠超聲破碎，每次15～20 s，停30 s，共10次.　4℃，17 000 r/min，30 min離心得上清粗提液.　粗提液蛋白濃度測(cè)定按215～225 nm光吸收差法?！　　〈痔嵋褐衕TNFα活性檢測(cè)采用在放線菌素D存在下，TNF對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性方法［21］，以殺死50%細(xì)胞（接種2～3104細(xì)胞/孔）的TNF的稀釋度為1個(gè)活性單位（U）。第五章 建廠條件和廠址方案 建廠條件 廠址的地理位置、地址、地貌概況 該項(xiàng)目擬建場(chǎng)址位于鄒平縣城東部，坐落于鄒平縣經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)內(nèi)，鄒長路以南，距鄒平熱電廠2公里，距離濟(jì)青高速公路鄒平出口6公里。鄒平縣地處魯中山區(qū)北部邊緣，黃河下游南岸，東南與淄博市周村區(qū)為鄰，東西與桓臺(tái)縣、章丘市接壤，北臨小清河與高青縣接壤，西距濟(jì)南67公里，東距青島260公里。鄒平縣地理位置優(yōu)越，交通十分便利，北依黃河，南依膠濟(jì)鐵路，濟(jì)青高速公路從縣城南側(cè)通過，慶淄路、章索路交會(huì)縣城。鄒平縣境內(nèi)山嶺綿延起伏，屬低山丘陵地貌類型，地形南高北低，由南部向北逐漸傾斜。東部、西部是山前沖積平原。北部和西北部是黃泛平原。本項(xiàng)目擬建地址區(qū)域地勢(shì)平坦。 工程地質(zhì)及水文地質(zhì)根據(jù)臨近地質(zhì)報(bào)告，廠址場(chǎng)地內(nèi)地勢(shì)平坦，該場(chǎng)址的主要土層：0～4米為亞砂土、4～8米為亞砂粉沙互層、8～200米為亞砂和亞粘土為主?，F(xiàn)有資料證實(shí)，本場(chǎng)址無活動(dòng)坍塌地帶、斷裂帶、地下蘊(yùn)礦帶、石灰坑及熔巖洞區(qū)存在。地下水主要接受大氣降水補(bǔ)給和地表水體補(bǔ)給，排泄主要以潛水蒸發(fā)為主。根據(jù)該區(qū)含水層結(jié)構(gòu)不同，分為以下三個(gè)含水層：第一含水層組：主要包括10米以上含水層，地下水主要受降水和灌溉水回灌補(bǔ)給，潛水蒸發(fā)強(qiáng)烈，～2克/升，屬重碳酸－氯化物型水?？梢赃m度開發(fā)利用。第二含水層組：含水層深埋10～200米之間，含水層巖性以亞砂和亞粘土為主，由于特殊的地質(zhì)條件，造成該含水層地下水礦化度達(dá)到5克/升，不能被開發(fā)利用。第三含水層組：含水層深埋在200米以下，為深層承壓含水層，含水層巖性以細(xì)粉砂為主，水質(zhì)良好，易被開發(fā)利用。根據(jù)國家地震局、建設(shè)部震發(fā)辦（1992）160號(hào)文《中國烈度區(qū)劃圖（1990）》，鄒平縣地震基本烈度為6度。 氣象條件本地區(qū)屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，氣溫適宜，四季分明。冬季最長，夏季次之，春秋季最短。(1)氣溫～℃℃極端最低溫－℃采暖期為115天。（2）濕度年平均相當(dāng)濕度：64％（3）年平均降雨量 年最大降雨量 600～700mm降雨主要在8月份，％，4）風(fēng)年平均風(fēng)速 年平均最大風(fēng)速 年最多風(fēng)向 南東風(fēng) 頻率 ％次主導(dǎo)風(fēng)向?yàn)? 西北西風(fēng)