利用實(shí)時(shí)定量pcr和2ct法分析基因相對(duì)表達(dá)量(編輯修改稿)
2025-07-27 18:39 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的表達(dá)。表顯示了大腦和腎臟總 中 和 轉(zhuǎn)錄本的 值。在這一個(gè)例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過計(jì)算得到腎臟 表達(dá)量經(jīng) 校正後相對(duì)于大腦的表達(dá)量的結(jié)果。盡管相對(duì)定量方法可用于這種組織之間的比較，但結(jié)果的生物學(xué)解釋是相當(dāng)復(fù)雜的。不同種類細(xì)胞中目標(biāo)和參照轉(zhuǎn)錄本單一的相對(duì)量變化可能在任何特定的組織中都存在。. －△△方法的數(shù)據(jù)分析實(shí)時(shí)定量所得到值可以很容易的輸出到表格程序如 中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過程，我們?cè)谶@里給出了一個(gè)基因表達(dá)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和樣本列表。通過β 均一化處理，我們對(duì)目標(biāo)基因 的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。在 的時(shí)間范圍內(nèi)，在每一時(shí)間點(diǎn)都取 個(gè)重復(fù)樣本，每一樣本在 合成之後都做定量 ，數(shù)據(jù)分析用到了公式，即： 表示任意時(shí)間點(diǎn)， 表示經(jīng)β 校正后 倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。 時(shí)刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均（見圖 第 欄）被用于公式 中。通過公式 計(jì)算出每一個(gè)樣本目標(biāo)基因表達(dá)通過β 均一化處理後相對(duì)于 時(shí)刻的倍數(shù)（見圖 第 欄）。平均， 由每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取的三個(gè)重復(fù)樣求得。用這種分析方法，在 時(shí)刻的平均倍數(shù)變化接近于。我們發(fā)現(xiàn)通過檢測(cè)在 時(shí)刻平均倍數(shù)變化是否為 可以很方便的驗(yàn)證三個(gè)重復(fù)樣品之間是否有錯(cuò)誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與偏差很大，則表明存在計(jì)算錯(cuò)誤或者是很高的實(shí)驗(yàn)誤差。在前面的例子中，在每一時(shí)間點(diǎn)上分別取了三個(gè)獨(dú)立的 樣本進(jìn)行了分析。因此對(duì)每一個(gè)樣本分別處理，通過計(jì)算後取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進(jìn)行 擴(kuò)增的重復(fù)，這就需要首先求出平均，然後再進(jìn)行 計(jì)算。怎么樣計(jì)算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個(gè)管子中擴(kuò)增還是在不同的管子中擴(kuò)增。表 給出了目標(biāo)基因（ ）和內(nèi)參基因（ ）在不同管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個(gè)的 管子和 管子作比較，而應(yīng)該分別計(jì)算出 和 的平均 來計(jì)算△ 。重復(fù)實(shí)驗(yàn)中值的估計(jì)偏差通過標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化成最後結(jié)果中相對(duì)量的變化。但其中的一個(gè)難點(diǎn)是 值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第 部分），因此，在最後的計(jì)算中，的誤差通過△△ 加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和△△ 減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來評(píng)估，這就使得求得的數(shù)值相對(duì)于平均值呈不對(duì)稱分布。不對(duì)稱分布是因?yàn)榻Y(jié)果經(jīng)指數(shù)處理後轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。通過不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序列。表 給出了目標(biāo)基因（ ）和內(nèi)標(biāo)基因（）在同一管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)于任意一個(gè)管子，目標(biāo)基因（ ）和內(nèi)參基因（）擴(kuò)增時(shí)加入的 量都是一樣多的，所以可以分別對(duì)每個(gè)管子計(jì)算△ 值，這些值取平均后再進(jìn)行計(jì)算。 在這里估計(jì)誤差值也是一個(gè)不對(duì)稱的
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