【文章內(nèi)容簡介】 有關(guān)硝基呋喃類抗生素的殘留檢測方法的文獻中，早期的文獻報道大多數(shù)是檢測原藥化合物。然而由于硝基呋喃類抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點，在動物體內(nèi)的半衰期不過數(shù)小時，通常不太可能檢出原藥的殘留，例如呋喃唑酮在停藥后12h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)在動物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，在停藥后至少6周內(nèi)AOZ在豬肌肉組織中繼續(xù)存在 [10]，因此當(dāng)原藥濃度降至檢測限以下時，檢測其代謝物濃度是可能的。其他硝基呋喃類抗生素也有類似特性?，F(xiàn)在各研究機構(gòu)已開始關(guān)注其代謝物的檢出，國內(nèi)外報道過用于檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘留的方法主要有色譜分析方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。 色譜分析方法高效液相色譜法(HPLC)在硝基呋喃類抗生素的檢測中比較常見， HPLC法所用的檢測器文獻報道較多的有紫外檢測器(UV，包括二極管陣列檢測器DAD)和電化學(xué)檢測器(ECD) 。近年來各種色譜聯(lián)用技術(shù)分析法在硝基呋喃類抗生素的代謝物的檢測中應(yīng)用較多，發(fā)展迅速，主要是與質(zhì)譜聯(lián)用（包括串聯(lián)質(zhì)譜）。 高效液相色譜法 (HPLC)（1）液相色譜紫外檢測器(LCUV)在硝基呋喃類抗生素原藥化合物的檢測中高效液相色譜應(yīng)用最多，而高效液相色譜最常用的檢測器就是紫外檢測器(UV，包括二極管陣列檢測器DAD)。通常用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定硝基呋喃類藥物代謝物時，因為呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導(dǎo)致靈敏度過低，不能滿足出口產(chǎn)品檢測硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留限量的要求 [11]。經(jīng)衍生化試劑衍生化后，產(chǎn)生強紫外吸收，第一章 引 言 8 其檢測限可以達到1μg/kg，但是復(fù)雜的基質(zhì)會導(dǎo)致測定困難和干擾。Angelini [12]利用LCUV 方法檢測牛肌肉組織中四種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。我國農(nóng)業(yè)部于2022年11月1日發(fā)布農(nóng)牧發(fā)[2022]38號文件，發(fā)布了10種動物源食品中獸藥殘留檢測方法，其中呋喃唑酮的檢測方法就是高效液相色譜法(紫外檢測器)。這個標準方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟組織和魚肉中呋喃唑酮殘留量的檢測，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟、魚肉組織中的檢測限分別為50、50、25μg/kg，回收率分別為80%~110%、 60%~130%、50%~140%、70%~120%。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批間變異系數(shù)CV≤25%。葛寶坤等 [13]采用固相萃取(SPE)前處理凈化技術(shù)，高效液相色譜(配有紫外檢測器) 法快速測定雞肉、魚、蝦中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量，4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚、蝦樣品中3個不同水平的添加回收率(n=7) 為87%~102%；相對標準偏差(RSD)%~%；工作曲線的線性范圍為5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為2μg/kg 。于慧娟等 [14]利用高效液相色譜法(配有紫外檢測器)測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，其方法靈敏度高。由此可見，高效液相色譜( 紫外檢測器)檢測硝基呋喃類抗生素的方法已逐漸趨于成熟，靈敏度不斷提高，檢測限能滿足國內(nèi)外水產(chǎn)品中微量呋喃唑酮測定的要求。（2）液相色譜電化學(xué)檢測器(LCECD)電化學(xué)檢測器(ECD) 因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測中得到應(yīng)用。Owen [15]利用LCECD( 工作電極為玻碳電極，工作 ，參比電極為Ag/AgCl電極)檢測用含有呋喃唑酮的飼料喂養(yǎng)的雞的肝臟和胸部肌肉組織中的呋喃唑酮的殘留。 [16]利用HPLCECD( 庫侖法) 來檢測牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮。樣品經(jīng)提取凈化后，以(28∶72)%的冰醋酸為流動相，在NovaPakC18柱上分離，CoulochemⅡ檢測器檢測(工作電極為多孔石墨電極，工作電位600mV)。標準曲線的線性良好，線性范圍在10~60ng/ml。其中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r分別為第一章 引 言 9 、(Height) 、 (Area)。相對標準偏差(n=11)分別為 %、%、%(Height)%、%、%(Area)，檢測限分別為4ng/ml(Height) 和4ng/ml(Area)。在25ng/ml 的添加回收率分別為(85177。11)%~(97177。9)% 、(87177。1)%~(97177。6)%、(83177。4)%~(98177。9)%。AlawiMA [17]利用改進的HPLC/ELCD 高效液相色譜電化學(xué)檢測器檢測雞組織和雞蛋中的呋喃唑酮和鹽酸呋喃它酮。%~%。呋喃唑酮的檢測限為1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測限為2ng/g。 聯(lián)用技術(shù)分析法（1）液相色譜質(zhì)譜法(LCMS)色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機化合物的定量分析，但定性較困難；質(zhì)譜儀只能夠?qū)我唤M分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，但對復(fù)雜化合物分析無能為力。將色譜和質(zhì)譜技術(shù)進行聯(lián)用，對混合物中微量或痕量組分的定性和定量分析具有重要意義 [18]。近些年來，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)(LCMS)測定硝基呋喃類代謝物在動物組織中的殘留越來越多被采用，與用紫外檢測器的檢測方法比較，質(zhì)譜檢測器技術(shù)具有定性、定量準確，抗干擾能力強，檢測限低，測定快速等特點 [17]。對被測化合物的確認有很高的可信度，具有靈敏度高(比UV檢測器高10倍以上)、選擇性好、精密度高等優(yōu)點，而且HPLCMS有易于操作和自動化的特點。LCMS 法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，可以排除酶聯(lián)免疫方法和HPLC法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。目前HPLCMS 連用技術(shù)已經(jīng)成為制藥業(yè)、藥物分析與研制等領(lǐng)域十分重要的分析方法，在環(huán)境分析中也起著重要作用，同時也是生物化學(xué)和生物技術(shù)大量使用的工具。近幾年國內(nèi)外采用HPLCMS對各種藥物及其代謝物的研究取得了一定的進展。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL TDLO實驗室建立了完整的LCMS 法檢測呋喃唑酮代謝物AOZ 及其他代謝物 [19]。HorneE 等進一步對該方法進行改進，利用 SPE簡化了衍生后的呋喃唑酮代謝物NPAOZ的提取過程，再用LCMS 法進行定性分析，對檢測豬肝中呋喃唑酮代謝物AOZ的不同方法進行比較研究，表明利用HPLC法和LCMS法測定 AOZ的結(jié)果基本相同 [20]。Rosa Draisci等 [32]利用HPLC第一章 引 言 10 DAD(光二極管陣列檢測器)檢測雞蛋中硝基呋喃類藥物殘留并用HPLCMS進行確認。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用HPLCMS方法檢測限分別為、。Robert Kennedy[21]提出一種用HPLCUV和LCMS 方法檢測動物性食品中硝基呋喃類抗生素呋喃唑酮。在溶解提取物用鋁土柱凈化后，用HPLCUV篩選可能含有呋喃唑酮的樣品，LCMS 方法用來確定證實陽性樣品。Robert Kennedy[20]利用LCMS方法測定豬組織中呋喃唑酮的代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)，組織樣品先用甲醇水反復(fù)溶解洗滌并用2硝基苯甲醛衍生化后分析測定。肝臟和肌肉組織的檢測限為10ng/g，回收率大于80%。用此方法在北愛爾蘭豬呋喃唑酮殘留事件中對100個豬腎臟樣品進行了測定，7份濃度在1~5ng/g之間，4份小于1ng/g ，還有1份達到144ng/g。目前，HPLC、LCMS 相關(guān)聯(lián)的NPAOZ 提取方法已經(jīng)得到改良，并通過一系列的加標樣品研究得以驗證。徐維海等采取LCMS法研究呋喃唑酮及其主要代謝產(chǎn)物AOZ在羅非魚體內(nèi)的殘留規(guī)律，利用該方法對呋喃唑酮及其代謝物AOZ的檢出限分別為1μg/kg [22]。由此可見LCMS 是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強、快速的分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。但是其儀器設(shè)備的購置和運行費用較高，成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。（2）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)最近幾年用于檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的LCMS/MS方法發(fā)展迅速，它是一種靈敏度更高、選擇性更好、特異性更強的一種方法，歐盟目前認為HPLCMS只能用于對硝基呋喃代謝產(chǎn)物進行篩選實驗，對檢出的陽性結(jié)果必須再用LCMS/MS 進行確證。歐盟 EEC/657/2022指令規(guī)定對于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達到四個確證點(一個質(zhì)譜離子為一個確證點)。顯然，并非所有的殘留檢測實驗室都具備HPLCMS/MS 儀器條件 [45]。目前許多國家已將LCMS/MS方法作為檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的確證性方法。Alexander Leitner等 [23]提出用LCMS/MS方法同時分析動物肌肉組織中四種硝基呋喃類抗生素的代謝物的方法。被分析物被酸性水解從組織中釋放，用2硝基苯甲醛衍生化，利用固相萃取(SPE)將樣品凈化。四種硝基呋喃類抗生素代謝物第一章 引 言 11 AOZ、 AMOZ、SC 、定量限分別是、測定響應(yīng)值的線性范圍從檢測限到 800ng/g之間。 [24]也利用LCMS/MS方法對來自歐洲15個國家的1500個市場購買的豬肉樣品進行四種硝基呋喃類抗生素的代謝物殘留的檢測，方法的定量限分別(AOZ、AMOZ)、(SC)、(AH)，在1500個樣品中檢測出12份樣品有代謝物殘留，并得以確證。Pascal Mottier等 [25]利用LCMS/MS方法，電噴霧電離(ESI) ，內(nèi)標法定量檢測肉中4種硝基呋喃類抗生素的代謝物，~，~，低于歐盟規(guī)定的1μg/kg 的最低檢測限量的要求。彭濤等 [11]利用LCMS/MS方法同時測定動物肌肉組織中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。定量限AMOZ、SC；檢測限AMOZ、AOZ均，SC、。~10ng/g范圍內(nèi)，AMOZ回收%~%，%~%，AH回收率為%~%，%~%，相對標準偏差(RSD)%。余建新等 [26]采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測方式建立了蜂蜜及水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時測定的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)方法。~，線性范圍均102 ，線性方程的相關(guān)系數(shù)r ，回收率為 %~%。目前，我國已將液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)作為測定蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的標準測定方法(GB/)，從2022年8月1日開始實施。 分光光度法分光光度法主要是用來測定動物飼料中呋喃唑酮等硝基呋喃類藥物添加劑。廖峰等 [27]利用分光光度法測定飼料中的呋喃唑酮，這種方法是將飼料試樣中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺(DMF)提取出來，使其與苯肼鹽酸溶液反應(yīng)，產(chǎn)生亮黃色的反應(yīng)物，再用甲苯萃取后，在440nm處用分光光度計讀取其吸光值，從而進行測定。此方法測定簡便，線性相關(guān)系數(shù)r，試樣回收率在95%~102% 之間。BautistaOrdonezJA等 [28]利用分光光度法測定出售的雞飼料中的呋喃西林和呋喃唑酮的濃度，并檢測到飼料中有呋喃西林和呋喃唑酮的存在。分光光度第一章 引 言 12 法可以判定動物性產(chǎn)品中是否存在硝基呋喃類藥物，且該法不需昂貴的儀器與試劑，也沒有復(fù)雜的樣品前處理，操作簡單，對于硬件設(shè)備不夠完善的質(zhì)檢部門和生產(chǎn)企業(yè)有較好的推廣及應(yīng)用價值，但測定結(jié)果準確度不高，最低檢測限較高，靈敏度低，不能作為確證性方法。 免疫分析法（IA）國內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類抗生素的免疫分析方法的報道很少?，F(xiàn)有的文獻報道的方法也只有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA方法，ELISA方法的優(yōu)點是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速；缺點是仍不能實現(xiàn)在線檢測，而且假陽性率較高。羅杰、李健 [29]建立了呋喃唑酮間接競爭ELISA檢測法，將呋喃唑酮與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)聯(lián)接，分別作為免疫原及包被原，建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織中呋喃唑酮的ELISA篩選方法，測定的最適范圍為10~100ng/ml，最小檢測限為1ng/ml。%，板間差異為 %，實驗重復(fù)性好，添加回收率試驗測得蝦肉樣本平均回收率為(177。)%，在試驗濃度范圍內(nèi)，呋喃唑酮的抗血清與呋喃西林的交叉反應(yīng)性為43%，與其他藥物未顯示免疫交叉反應(yīng)性。競爭性酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)(雙抗體反應(yīng) )。所涉及的設(shè)備有組織搗碎機、微孔板酶標儀(450nm)、離心機、振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、磁力攪拌器、微量加樣器、多道移液器、混合器(旋轉(zhuǎn)后超聲) 等。各種硝基呋喃類物質(zhì)代謝物中以AOZ較為典型，以此為例。其原理是：將被測樣本中的結(jié)合代謝殘留物經(jīng)水解、衍生形成NPAOZ，其與過氧化物酶標記的NPAOZ競爭結(jié)合有限的NPAOZ抗體(競爭性酶免疫分析)，同時此抗體又與包被在微孔板條上針對它的抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的NPAOZ后，加入酶反應(yīng)底物和生色劑到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm 處測量( 選擇參比波長600nm)，吸光度與樣品中的 AOZ濃度成反比。其分析方法：①方法檢測限和定量檢測限。根據(jù)試劑空白A450值由校準曲線求出相應(yīng)濃度，以其 3倍標準偏差和10倍標準偏差乘以前處理稀釋倍數(shù)2分別作為檢測限(LOD)和定量檢測限(LOQ)，得到相應(yīng)的試劑空白對應(yīng)的濃度，標準偏差SD；檢測限(LOD) ；定量檢測限(LOQ)；②方法回收率和精密度。添加實驗是在陰性樣品中加入AOZ標準溶液后按樣品前處理和樣品分析