【正文】 )色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機化合物的定量分析，但定性較困難；質(zhì)譜儀只能夠?qū)我唤M分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，但對復(fù)雜化合物分析無能為力。%~%。9)%。6)%、(83177。9)% 、(87177。在25ng/ml 的添加回收率分別為(85177。其中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r分別為第一章 引 言 9 、(Height) 、 (Area)。樣品經(jīng)提取凈化后，以(28∶72)%的冰醋酸為流動相，在NovaPakC18柱上分離，CoulochemⅡ檢測器檢測(工作電極為多孔石墨電極，工作電位600mV)。Owen [15]利用LCECD( 工作電極為玻碳電極，工作 ，參比電極為Ag/AgCl電極)檢測用含有呋喃唑酮的飼料喂養(yǎng)的雞的肝臟和胸部肌肉組織中的呋喃唑酮的殘留。由此可見，高效液相色譜( 紫外檢測器)檢測硝基呋喃類抗生素的方法已逐漸趨于成熟，靈敏度不斷提高，檢測限能滿足國內(nèi)外水產(chǎn)品中微量呋喃唑酮測定的要求。葛寶坤等 [13]采用固相萃取(SPE)前處理凈化技術(shù)，高效液相色譜(配有紫外檢測器) 法快速測定雞肉、魚、蝦中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量，4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚、蝦樣品中3個不同水平的添加回收率(n=7) 為87%~102%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)%~%；工作曲線的線性范圍為5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為2μg/kg 。這個標(biāo)準(zhǔn)方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟組織和魚肉中呋喃唑酮殘留量的檢測，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟、魚肉組織中的檢測限分別為50、50、25μg/kg，回收率分別為80%~110%、 60%~130%、50%~140%、70%~120%。Angelini [12]利用LCUV 方法檢測牛肌肉組織中四種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。通常用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定硝基呋喃類藥物代謝物時，因為呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導(dǎo)致靈敏度過低，不能滿足出口產(chǎn)品檢測硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留限量的要求 [11]。近年來各種色譜聯(lián)用技術(shù)分析法在硝基呋喃類抗生素的代謝物的檢測中應(yīng)用較多，發(fā)展迅速，主要是與質(zhì)譜聯(lián)用（包括串聯(lián)質(zhì)譜）。現(xiàn)在各研究機構(gòu)已開始關(guān)注其代謝物的檢出，國內(nèi)外報道過用于檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘留的方法主要有色譜分析方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。然而由于硝基呋喃類抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點，在動物體內(nèi)的半衰期不過數(shù)小時，通常不太可能檢出原藥的殘留，例如呋喃唑酮在停藥后12h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)在動物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，在停藥后至少6周內(nèi)AOZ在豬肌肉組織中繼續(xù)存在 [10]，因此當(dāng)原藥濃度降至檢測限以下時，檢測其代謝物濃度是可能的。方法用雙相透析膜將待測物在線分離，然后用第一章 引 言 7 液相色譜柱（Bondapak C18/Corasil，37~50μm，或者 XAD4，50~100μm ）將 4種硝基呋喃預(yù)富集，先將共萃取的基質(zhì)淋洗至廢液中，再將濃縮的分析物沖到分析柱上分離，用紫外檢測器檢測，可達(dá)到 1~5μg/kg 的檢出限。此外，高通量的 96 孔板，可滿足處理大量樣品的要求。SPE 的特點包括穩(wěn)定可靠，有更好的重現(xiàn)性和高的回收率，不會產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，可消除乳化，減少溶劑的使用，可用于大范圍內(nèi)的不同基質(zhì)。其他可供選擇的柱還有如 Waters Oasis HLB SPE、Varian Bond Elut ENV/LMS、Supelco Supelclean EnviChrom P、JT Baker Bakernond H2Ophobic DVB、 IST Isolute101 等。 SPE 柱有多種，如 Phenomenex SDBL 反相聚合的苯乙烯二乙烯基苯柱，基于共聚物憎水性和 ππ 共軛鍵的相互作用，該柱對硝基呋喃有很強的選擇性保留，而大多數(shù)基質(zhì)干擾物保留較弱，能保留、洗脫硝基呋喃的 4 種待測物，效果很好。用固相萃取柱可以從共萃取物中凈化和濃縮硝基呋喃萃取物。 固相萃取技術(shù)（SPE）固相萃取技術(shù)是一種色譜凈化技術(shù)。 基體固相分散技術(shù) （MSPD）基體固相分散技術(shù)是將硅藻土或非極性的 C18 衍生硅膠等作為吸附劑，加第一章 引 言 6 入到樣品中，混合均勻，或者樣品與吸附劑一同研磨，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填充到層析柱中，用溶劑淋洗，達(dá)到凈化的目的，該技術(shù)可以克服液液萃取過程中產(chǎn)生乳化的問題。為了達(dá)到更好的凈化效果，正己烷常被用于對樣品萃取液的進(jìn)一步脫脂。 液液萃取（LLP ）液液萃取是最經(jīng)典、常用的凈化手段，可以用有機溶劑將待測物從溶液中萃取出來，或者將干擾物質(zhì)從有機相或水相萃取物中除去。常用的凈化技術(shù)包括傳統(tǒng)的液液萃?。↙LP） 、固相萃?。⊿PE ） 、基體固相分散技術(shù)（MSPD ） 、在線透析和微量富集技術(shù)。 樣品的凈化通常，得到的水提取液或有機提取液中，目標(biāo)分析物濃度較低，還含有許多共萃取基質(zhì)，如果這些物質(zhì)在最終的溶液中存在，不僅會干擾檢測，也會增加背景噪聲，無法測定痕量濃度的目標(biāo)分析物。通過采用 2NBA 進(jìn)行衍生化，使得上述代謝物的衍生物NPSEM、NPAOZ、NPAHD、NPAMOZ 相對分子質(zhì)量分別達(dá)到、在適當(dāng)?shù)呐鲎搽妷合戮a(chǎn)生不少于兩個特性離子的碎片峰，MS 檢測靈敏度提高，更適合于質(zhì)譜的定性和定量。同樣地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白結(jié)合代謝物，經(jīng)酸水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 SEM、 AMOZ 和 AHD。2NBA 是采用最多的衍生化試劑，該類衍生物在色譜柱上有較好的保留，在質(zhì)譜儀上有特征的離子碎片，靈敏度高。通常水解選用稀鹽酸，濃度為 。除此之外，三氯乙酸、甲醇/乙醇/二乙醚、Mcllvaine 緩沖溶液/甲醇、偏磷酸/ 甲醇、檸檬酸/磷酸氫二鈉、氯仿/乙酸乙脂/二甲基亞砜都有應(yīng)用的報道。在樣品的提取和去蛋白過程中，有機溶劑也能從內(nèi)源性大分子中萃取非共價鍵結(jié)合的殘留物。粉碎后的樣品，用水、氯化鈉溶液或鹽酸溶液混合均相；奶類和蜂蜜等樣品的處理，可直接用水或鹽酸溶液混合均勻。對于蝦類樣品的處理，先粉碎均勻，再冷凍儲存，但對其他肌肉組織、腎臟和肝臟等樣品，需要先冷第一章 引 言 4 凍，后選擇有代表性部分切成薄片，再進(jìn)一步粉碎。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的樣品處理方法樣品的處理通常包括均質(zhì)、提取、凈化、衍生化等步驟，以達(dá)到釋放殘留物特別是蛋白結(jié)合殘留物、去除干擾基質(zhì)、濃縮目標(biāo)分析物的目的。（5）加強獸藥殘留監(jiān)控。養(yǎng)殖過程是獸藥殘留監(jiān)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，養(yǎng)殖者是動物源性食品安全的主體，其安全用藥與否直接關(guān)系到食品安全。飼料生產(chǎn)企業(yè)要加強對生產(chǎn)原料的管理，做到原料來源清楚，記錄明確；要加強對原料檢測，重點加強對魚粉原料的檢測；要防止含有硝基呋喃類藥物的飼料原料投入生產(chǎn)，防止在生產(chǎn)過程中污染違禁藥物。（3）加強飼料生產(chǎn)管理。（2）加強獸藥生產(chǎn)經(jīng)營管理。第一章 引 言 3 （1）加強培訓(xùn)與宣傳，提高安全用藥意識。2022 年開始，我國將硝基呋喃納入殘留監(jiān)控計劃中。2022 年 4月，我國農(nóng)業(yè)部第 193 號公告(食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單)將硝基呋喃類藥物列為禁止使用的藥物。韓國 2022 年版《食品公典》規(guī)定豬肉中不得檢出呋喃唑酮。我國農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2022]號也規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。歐盟(EU)N0807/2022 法規(guī)中，規(guī)定使用 HPLC 方法檢測呋喃唑酮，檢測限量 2ng/kg~4ng/kg。1990 年 7 月歐盟頒布 2377/90/EEC 條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物列為 A 類禁用藥物，規(guī)定其在動物源性食品中的殘留檢測限為[3]。 硝基呋喃類藥物的管理對策由于硝基呋喃類藥物殘留危害嚴(yán)重，美國、日本和歐盟等國家和地區(qū)紛紛采取措施，嚴(yán)加監(jiān)管。這些代謝物可以在弱酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此，當(dāng)人類吃了含有硝基呋喃類抗生素殘留的食品，這些代謝物就可以在人類胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來被人體吸收而對人類健康造成危害。用呋喃唑酮對種雞進(jìn)行處理以后，代謝物殘留將按種雞種蛋 雛雞成雞的生物鏈條傳遞。（3）代謝產(chǎn)物對人體危害嚴(yán)重。通過對小白鼠和大白鼠的毒性研究表明，呋喃唑酮可以誘發(fā)乳腺癌和支氣管癌，并且有劑量反應(yīng)關(guān)系；高劑量飼喂食用魚和觀賞魚，可誘導(dǎo)魚的肝臟發(fā)生腫瘤；繁殖毒性結(jié)果表明，呋喃唑酮能減少精子的數(shù)量和胚胎的成活率。（2）具有致癌致畸致突變。在硝基呋喃類藥物中，以呋喃西林對家禽的毒性作用最常見，尤其是雛鴨和雛雞，以220mg/kg混飼喂雛鴨或以400mg/kg混飼喂雛雞，連續(xù)用藥10天以上，出現(xiàn)呆滯、羽毛蓬松、厭食或興奮、驚厥癥狀，最后死亡。 硝基呋喃類藥物的危害及其管理對策 硝基呋喃類藥物的主要危害（1）對畜禽有毒性作用。呋喃唑酮用于防治畜禽腸道感染，如兔球蟲病、豬痢疾、禽白痢、火雞黑頭病等 [2]。呋喃唑酮用于防治水生動物疾病，如用1μg/kg~2 μg/kg防治觀賞魚蛀鰭爛尾病和羅非魚潰爛病。呋喃類藥物內(nèi)服后，吸收較少，吸收的部分在體內(nèi)迅速被破壞，血藥濃度低，不易達(dá)到有效濃度，不宜用于全身感染的治療。呋喃西林難溶于水(1:4200)，微溶于乙醇(1:590) ，呋喃唑酮幾乎不溶于水和乙醇；呋喃妥因幾乎不溶于水，微溶于乙醇。目 錄 I 動 物 組 織 中 硝 基 呋 喃 代 謝 物 殘 留 量 的 測 定 方 法畢 業(yè) 論 文第 一 章 目 錄摘 要 .......................................................................................................... IABSTRACT（英文摘要） ............................................................................ Ⅱ 目 錄 .......................................................................................................... Ⅲ第一章 引 言 ............................................................................................. 1 硝基呋喃類藥物的性質(zhì)和使用 ..................................................................... 1 硝基呋喃類藥物的危害及其管理對策 ......................................................... 2 硝 基 呋 喃 類 藥 物 的 主 要 危 害 ..................................................... 2 硝 基 呋 喃 類 藥 物 的 管 理 對 策 ..................................................... 3 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的樣品處理方法 ............................................. 4 樣 品 的 均 質(zhì) ............................................................................... 4 提 取 和 衍 生 化 ........................................................................... 5 溶 劑 提 取 ............................................................................. 5 水 解 和 衍 生 化 ...................................................................... 5 樣 品 的 凈 化 ............................................................................... 6 液 液 萃 取 （ LLP） ............................................................... 6 基 體 固 相 分 散 技 術(shù) （ MSPD） ............................................. 6 固 相 萃 取 技 術(shù) （ SPE） ........................................................ 7 在 線 透 析 和 微 量 富 集 技 術(shù) ................................................... 7 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測方法 ..................................................... 8 色 譜 分 析 方 法