【正文】 進行平行實驗。得到平均回收率和變第一章 引 言 13 異系數(shù)RSD；③方法重現(xiàn)性。測定了不同批次(n=5)測試時添加實驗的變異系數(shù)。不同的添加水平，得到相應(yīng)的平均回收率和變異系數(shù)RSD；④交叉反應(yīng)。另外幾種硝基呋喃類藥物呋喃他酮(AMOZ)、呋喃妥因(AHD)和硝基呋喃腙(SEM) 的藥代動力學(xué)與呋喃唑酮相似，共同的亞糠基主鏈代謝很快，而相應(yīng)的側(cè)鏈AMOZ、AHD和SEM結(jié)構(gòu)差異較大，其2NBA衍生物與NPAOZ相比，其IC50均，即以NPAOZ為基準(zhǔn)抗原，%，表明此NPAOZ的蛋白抗體特異性良好 [30]。在所有恒溫孵育過程中，應(yīng)避免光線照射，用試劑盒中提供的蓋板蓋住微孔板。對檢測量大、條件較好的實驗室，可用全自動酶標(biāo)儀進行檢測，上述操作中的加樣、孵育、洗板、發(fā)色、終止、測量、計算等步驟可全部由全自動酶標(biāo)儀來完成。對沒有全自動酶標(biāo)儀的實驗室而言，結(jié)果計算時也可用由試劑盒供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)處理軟件經(jīng)電腦進行處理。由于硝基呋喃類抗生素代謝迅速，目前國外報道的免疫分析方法都是針對硝基呋喃類抗生素代謝物的ELISA方法。2022年，Kevin [30]首先制備出了呋喃唑酮代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)的衍生物的高特異性多克隆抗體，其高靈敏度能夠滿足當(dāng)前獸藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)，為呋喃唑酮代謝物的免疫分析方法奠定了基礎(chǔ)。隨后， [30]又建立了蝦組織中呋喃唑酮組織結(jié)合代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)的酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)。通過分析20個樣品，使用陰性蝦樣品添，%%。IvaDiblikova等 [31]又制備出呋喃唑酮代謝物3氨基2 惡唑烷酮(AOZ)的衍生物的高特異性單克隆抗體并建立了直接競爭ELISA方法，其CCβ 值為 ，與已建立的確證性的LCMS/MS 。方法同LCMS/MS方法的相關(guān)性很好，r。目前已有呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒開發(fā)出來，而我國只能靠引進國外的試劑盒，現(xiàn)在各商檢部門所使用的和各生化試劑公司出售的都是德國rBiopharm公司生產(chǎn)的試劑盒，其價格昂貴。第一章 引 言 14 總結(jié)從以上對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測方法進行的綜述中可以看出，國內(nèi)外對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù)，另外還有免疫檢測方法和分光光度法等方法。高效液相色譜(HPLC) 方法的優(yōu)點是自動化、精確度高、假陽性率低，缺點是儀器昂貴、操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜、成本高、廢棄試劑易造成環(huán)境污染、需要專業(yè)分析人員。各種聯(lián)用技術(shù)如LCMS、LCMS/MS提高了分析的靈敏度、精確度，降低了檢測限，假陽性率更低，特異性更強，在藥物殘留分析中應(yīng)用發(fā)展迅速且前景廣闊，但同時也存在同HPLC方法一樣的缺點。ELISA方法具有快速、簡便、靈敏、方法種類多、高特異性等優(yōu)點，缺點是容易出現(xiàn)假陽性問題。分光光度法雖然操作簡單，但測定結(jié)果準(zhǔn)確度不高，靈敏度低，不能作為確證性方法。從選擇性、準(zhǔn)確性、靈敏性、穩(wěn)定性、操作難易及費用等方面綜合考慮，酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是比較好的殘留檢測方法，但不能作為確證方法。高效液相色譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)是硝基呋喃類抗生素及其代謝物的最終確證性的檢測方法。我國加入WTO以后，加大了同歐盟、美國、日本等發(fā)達國家的貿(mào)易往來，促進了我國經(jīng)濟的發(fā)展，但同時發(fā)達國家對我國推行的“綠色壁壘”“技術(shù)壁壘”問題也嚴重沖擊著我國對外出口貿(mào)易。發(fā)達國家對進口到他們國家的食品要求檢測的殘留藥物的數(shù)目越來越多，最高限量也越來越低，我國出口的動物性食品退貨的現(xiàn)象越來越多而造成很大損失。近幾年歐盟、美國、日本等發(fā)達國家對從我國進口的動物源性食品都要求嚴格檢測硝基呋喃類藥物及其代謝物。根據(jù)歐盟2022/621/EC決議，輸歐的蜂蜜和蜂王漿、養(yǎng)殖水產(chǎn)品、剝殼和/或加工蝦、小龍蝦、腸衣、兔肉必須出具相應(yīng)的化學(xué)殘留檢測證明。附加證明的主要內(nèi)容是：該產(chǎn)品出口前經(jīng)過獸藥殘留特別是氯霉素和硝基呋喃代謝物的檢測，檢測結(jié)果要符合以下要求:氯霉素；呋喃唑酮(AOZ)；呋喃它酮(AMOZ)；呋喃妥因(AH)；呋喃西林 (SC)。因此加快動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測方法的研究勢在必行。國外對硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù)，第一章 引 言 15 而且趨于成熟，其檢測限能滿足歐盟的1μg/kg的最低檢測限量的要求。而且國外也已經(jīng)開發(fā)出呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒。國內(nèi)對硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測起步較晚，同國外還有一段差距，起先多數(shù)是檢測硝基呋喃類原藥化合物，隨著發(fā)達國家要求對從我國進口的動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物進行檢測，現(xiàn)在國內(nèi)各研究機構(gòu)開始致力于硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法的研究，其檢測限也能滿足歐盟的最低檢測限量的要求。但國內(nèi)還沒有關(guān)于硝基呋喃類藥物代謝物的免疫分析方法的報道，目前國內(nèi)對試劑盒的使用還主要依靠從國外引進，其價格昂貴。如果能研制出檢測硝基呋喃類藥物代謝物的試劑盒，使其與同類進口試劑盒相比在靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、回收率方面接近或者優(yōu)于進口試劑盒，則能彌補國內(nèi)空白。因此，研制準(zhǔn)確、靈敏、特異性高、方便高效穩(wěn)定的檢測硝基呋喃類藥物代謝物的試劑盒是今后國內(nèi)檢測硝基呋喃類藥物代謝物殘留方法的目標(biāo)和方向，值得我們深入研究和開發(fā)。第一章 引 言 16 第二章 實驗方法 0 第 二 章 實 驗 方 法 原理組織樣品經(jīng)均質(zhì)后經(jīng) HCl 水解，采用 2硝基苯甲醛進行衍生化。水解產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用 %甲酸溶液溶解，較渾濁的樣品，如樣品蝦，可經(jīng)過乙酸乙酯提取，然后再經(jīng) SPE 凈化。液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定，內(nèi)標(biāo)法定量。 儀器和設(shè)備實驗使用的主要儀器及設(shè)備如下：表 21 主要儀器和設(shè)備及其型號或容量儀器及設(shè)備名稱 型號或容量液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜儀 Agilent1100， API4000，配有電噴霧離子源離心機 Eppendorf 5810R高速組織搗碎機 IKA T25氮氣濃縮裝置 PIERCE MODEL 1878快速混勻器 IKA MS2固相萃取真空裝置 SUPELCO 公司Eppendorf 移液器 ，均質(zhì)器 UltraTurrax恒溫振蕩裝置 MEMMER分析天平 Shimadzu SEU210一次性注射式濾器 配有 微孔濾膜聚四氟乙烯離心管 50mL棕色雞心瓶 100mLAgilent HPLC 微量進樣瓶 pH 計 上?？祪x PHS3C 型，測量精度177。分液漏斗 250mLEN SPE 柱 LiChroluT，200mg玻璃離心管 15mL第二章 實驗方法 1 試劑與溶液 主要試劑實驗所用到的主要試劑如下：表 22 主要試劑的純度及其生產(chǎn)廠家試劑名稱 純度 生產(chǎn)廠家乙腈 HPLC Grade B＆J Brand 公司甲醇 HPLC Grade B＆J Brand 公司甲酸 分析純 天津光復(fù)精細化工研究所乙醇 分析純 濟南三恩化工有限公司乙酸乙酯 HPLC Grade B＆J Brand 公司正己烷 HPLC Grade B＆J Brand 公司四氯化碳 優(yōu)級純 天津科密歐化學(xué)試劑公司二甲亞砜 GC Grade SigmaAldich氯化鈉 分析純 齊魯石化公司研究院試劑 廠氫氧化鈉 分析純 天津化學(xué)試劑三廠2硝基苯甲醛 HPLC Grade Fluka 公司鹽酸 分析純 淄博化學(xué)試劑廠無水硫酸鈉 分析純 上海光華科技有限公司水 MΩ 山東檢疫技術(shù)中心 主要溶液的配制實驗所用到的主要溶液的配制如下：第二章 實驗方法 2 表 23 主要溶液及其配制方法溶液名稱及濃度 配制方法鹽酸溶液(1mol/L) 移取 45mL 鹽酸于 500mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度鹽酸溶液（） 移取 125mL，1mol/L 鹽酸溶液于 1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度2硝基苯甲醛溶液（） 稱取 100177。 10mL 三角瓶中，加入 二甲亞砜，混勻30%氯化鈉溶液 稱取氯化鈉 300177。 氯化鈉于 1000mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度液態(tài)混合凈化試劑 移取 5mL 正己烷與 5mL 容量瓶中混勻甲酸溶液（%） 移取甲酸 1mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻甲酸溶液（%） 移取甲酸 2mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻甲醇水（50+50）溶液 甲醇與水等量混合，搖勻 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)溶液（1）實驗所用到的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)如下：表 24 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度及其生產(chǎn)廠家名稱 純度 生產(chǎn)廠家AMOZ %～％ SigmaAldrich 公司SEM %～％ SigmaAldrich 公司AOZ %～％ SigmaAldrich 公司AHD %～％ SigmaAldrich 公司AMOZD5 ％～ % Witega 公司SCA13C15N2 ％～ % Witega 公司AOZD4 ％～ % Witega 公司AHD13C3 ％～ % Witega 公司第二章 實驗方法 3 （2）實驗所用到的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制如下：表 25 標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制方法溶液名稱及濃度 配制方法標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1mg/mL）分別精確稱取50mgAOZ、AMOZ 、SEM 、AHD 至50mL 容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10μg/mL）移取 AOZ、AMOZ 、SEM 、AHD 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液各 500181。L 至 50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 100181。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻內(nèi)標(biāo)儲備液（1mg/mL）分別精確稱取 ，SCA13C15N2，AOZD 4，AHD 13C3 至 50mL 容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻混合內(nèi)標(biāo)中間液（10μg/mL）移取 AMOZD5，SCA 13C15N2，AOZD4，AHD 13C3 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液各 500181。L 至50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻混合內(nèi)標(biāo)工作液（100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合內(nèi)標(biāo)中間液 100181。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻 實驗方法 試樣制備與保存從所取原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機搗碎，用四分法縮分出不少于 500g 試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，樣品于20℃保存。 分析步驟 洗樣稱取 177。 試樣，置于 50mL 離心管中，用甲醇－水溶液 15mL2 洗滌，每次完畢后 4000r/min 離心 3min，棄上清；然后再用乙醇 20mL2 洗滌，每次完畢后 4000r/min 離心 3min，棄上清；最后用乙酸乙酯 15mL2 洗滌，每次完畢后 4000r/min 離心 3min，棄上清。第二章 實驗方法 4 該步操作適用于測定結(jié)合態(tài)的硝基呋喃代謝物，如需測定代謝物總量，可省去該步驟。 水解于離心殘留物中加50181。L混合內(nèi)標(biāo)工作液，（），8000r/min 勻漿約2min。勻漿液在37℃水浴中振蕩16h（過夜），頻率為 60Hz。而后用1mol/LNaOH或HCl調(diào)pH 至~，15℃4500r/min離心 15min，用125mm濾紙過濾上清液。 提取和凈化（1）乙酸乙酯提取將過濾后上清液轉(zhuǎn)移至 250mL 分液漏斗中，加入 20mL 乙酸乙脂振蕩提取，靜置分層，收集上層乙酸乙酯溶液，重復(fù)操作兩次，合并兩次乙酸乙酯提取液，加入 15mL30%NaCl 溶液振蕩，靜置分層，棄去下層 NaCl 溶液，重復(fù)操作兩次，合并乙酸乙脂提取液于棕色雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣流吹干，精密加入 %甲酸溶液和 液態(tài)混合凈化試劑渦旋混勻 ，轉(zhuǎn)移至15mL 離心管中，6000r/min 離心 5min，棄去下層液，再加入 液態(tài)混合凈化試劑重復(fù)操作，取上層溶液過 濾膜于進樣瓶中，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。（2）乙酸乙酯提取及 EN SPE 柱凈化（適用于高度渾濁濾液，如蝦、肝、蚌等樣品）將過濾后上清液加入到 LiChrolut EN 柱中， （預(yù)先用 3mL 乙酸乙酯、3mL甲醇和 5mL 水進行活化） ，用 3mL 水洗滌，壓干，直至其吸附劑的顏色由棕色變?yōu)槌壬?，?3mL 乙酸乙酯洗脫分析物，洗脫液經(jīng)氮氣流吹干，殘渣用 1mL流動相溶解，過 濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。 儀器參數(shù)與設(shè)定（1）液相色譜條件a) 色譜柱：Intersil ODS3,5μm,150mm()或相當(dāng)者；第二章 實驗方法 5 b) 柱溫： 20℃；c) 流動相：A：乙腈；B：%甲酸溶液d) 流動相及洗脫條件如表所示：表 26 流動相及梯度洗脫條件 時間（min） 流動相A(乙腈) 流動相B（%甲酸） 10% 90% 95% 5%95%10%10%5%90%90%e) 流速：； f) 進樣量：20181。L；（2）質(zhì)譜條件a) 離子源：電噴霧離子源；b) 掃描方式：正離子掃描；c) 檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測；d) 電噴霧電壓：5500V；e) 霧化氣壓力：；f) 氣簾氣壓力： ；g) 輔助氣壓力：；h) 離子源溫度：500℃； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定、