【正文】 增加，從而造成分析物的損失。 提取和衍生化 溶劑提取在樣品的提取步驟，要求能夠?qū)?dòng)物性食品中的硝基呋喃殘留物釋放至溶液中，一般使用水和酸化的有機(jī)溶劑，以達(dá)到去除大部分蛋白質(zhì)和萃取殘留物的目的。常用的有機(jī)溶劑包括乙腈、乙酸乙脂、二氯甲烷等。 水解和衍生化對(duì)于硝基呋喃代謝物的測(cè)定，鑒于其殘留物主要以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在，只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下經(jīng)水解過程，才能釋放出游離代謝產(chǎn)物，而且因殘留物的濃度一般非常低，需要采用衍生化手段提高靈敏度，故樣品的處理需要水解和衍生化。對(duì)衍生化試劑的選擇，許多研究者對(duì)此進(jìn)行了大量的探索，芳香醛類如 2硝基苯甲醛（2NBA） 、吡啶3 羰基甲醛、 2，4二硝基苯甲醛、2 羥基5硝基苯甲醛和 2氯苯甲醛，均能與硝基呋喃游離代謝產(chǎn)物的自由氨基團(tuán)反應(yīng)，形成具有較好特性的芳香亞胺類衍生物。以呋喃唑酮為例，肌肉組織在酸性條件下被水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 AOZ與 2NBA 發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成性質(zhì)穩(wěn)定的衍生物，該衍生物有紫外吸收，并可儲(chǔ)存于18 ℃ 冰箱內(nèi)數(shù)周不變。第一章 引 言 5 SEM、AOZ、AHD 和 AMOZ 的相對(duì)分子質(zhì)量分別為、在此質(zhì)量范圍內(nèi)，MS 噪音大，加上分析物較低的離子化效率和無特征的碎片行為，MS 檢測(cè)靈敏度很低，給定量特別是定性帶來困難。值得注意的是，許多細(xì)胞大分子也含有可反應(yīng)的氨基，需加入遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的2NBA 來確保由蛋白結(jié)合殘留釋放出的自由代謝產(chǎn)物全部衍生化。樣品凈化的目的就是為了減少萃取中的共萃取基質(zhì)，濃縮目標(biāo)分析物。在實(shí)際分析中，結(jié)合多種凈化和濃縮技術(shù)來減少檢測(cè)的背景噪聲，以達(dá)到定量分析微量殘留物的應(yīng)用也很常見。實(shí)驗(yàn)證明，在酸性條件下，乙酸乙脂、二氯甲烷對(duì)溶液中的硝基呋喃殘留物萃取效果好，也有加入氯化鈉以進(jìn)一步提高二氯甲烷萃取效率的報(bào)道。液液萃取的優(yōu)點(diǎn)是成本低，不需要特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，其缺點(diǎn)是在萃取過程中有時(shí)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，且有機(jī)溶劑消耗量大。 [6]等和 [7]等報(bào)道了硅藻土的應(yīng)用， [8]等利用非極性的 C18 衍生硅膠等作為吸附劑，成功地凈化了奶中的呋喃唑酮。將含待測(cè)物的溶液通過吸附層，使待測(cè)物保留在吸附層，經(jīng)洗脫除去雜質(zhì)，再選用合適的溶劑洗脫并收集目標(biāo)分析物。有學(xué)者報(bào)道用非極性吸附劑如反相 C18 或者 XAD2 可獲得高的回收率，然而在許多情況下，非極性吸附劑在從萃取物中除去干擾物的凈化過程并不理想，一些極性吸附劑例如硅膠、氧化鋁或者氨丙基材料也常常被采用，以達(dá)到更好的萃取凈化效果。LiChrolut EN 和 SDBL 柱可以提供相似的結(jié)果，但保留特性有少許差別。凈化過程包括柱子活化、淋洗和洗脫。此外，還容易自動(dòng)化，如自動(dòng)化的 SPE：ASPEC，為滿足不同樣品萃取量的需求，有各種不同體積的柱子可供選擇，包括碟式萃取片。 在線透析和微量富集技術(shù)[9]等報(bào)道在線透析和微量富集技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物源性食品肉類、奶類和蛋類中硝基呋喃的分析。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表有關(guān)硝基呋喃類抗生素的殘留檢測(cè)方法的文獻(xiàn)中，早期的文獻(xiàn)報(bào)道大多數(shù)是檢測(cè)原藥化合物。其他硝基呋喃類抗生素也有類似特性。 色譜分析方法高效液相色譜法(HPLC)在硝基呋喃類抗生素的檢測(cè)中比較常見， HPLC法所用的檢測(cè)器文獻(xiàn)報(bào)道較多的有紫外檢測(cè)器(UV，包括二極管陣列檢測(cè)器DAD)和電化學(xué)檢測(cè)器(ECD) 。 高效液相色譜法 (HPLC)（1）液相色譜紫外檢測(cè)器(LCUV)在硝基呋喃類抗生素原藥化合物的檢測(cè)中高效液相色譜應(yīng)用最多，而高效液相色譜最常用的檢測(cè)器就是紫外檢測(cè)器(UV，包括二極管陣列檢測(cè)器DAD)。經(jīng)衍生化試劑衍生化后，產(chǎn)生強(qiáng)紫外吸收，第一章 引 言 8 其檢測(cè)限可以達(dá)到1μg/kg，但是復(fù)雜的基質(zhì)會(huì)導(dǎo)致測(cè)定困難和干擾。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2022年11月1日發(fā)布農(nóng)牧發(fā)[2022]38號(hào)文件，發(fā)布了10種動(dòng)物源食品中獸藥殘留檢測(cè)方法，其中呋喃唑酮的檢測(cè)方法就是高效液相色譜法(紫外檢測(cè)器)。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批間變異系數(shù)CV≤25%。于慧娟等 [14]利用高效液相色譜法(配有紫外檢測(cè)器)測(cè)定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，其方法靈敏度高。（2）液相色譜電化學(xué)檢測(cè)器(LCECD)電化學(xué)檢測(cè)器(ECD) 因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測(cè)中得到應(yīng)用。 [16]利用HPLCECD( 庫侖法) 來檢測(cè)牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，線性范圍在10~60ng/ml。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=11)分別為 %、%、%(Height)%、%、%(Area)，檢測(cè)限分別為4ng/ml(Height) 和4ng/ml(Area)。11)%~(97177。1)%~(97177。4)%~(98177。AlawiMA [17]利用改進(jìn)的HPLC/ELCD 高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)雞組織和雞蛋中的呋喃唑酮和鹽酸呋喃它酮。呋喃唑酮的檢測(cè)限為1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測(cè)限為2ng/g。將色譜和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，對(duì)混合物中微量或痕量組分的定性和定量分析具有重要意義 [18]。對(duì)被測(cè)化合物的確認(rèn)有很高的可信度，具有靈敏度高(比UV檢測(cè)器高10倍以上)、選擇性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，而且HPLCMS有易于操作和自動(dòng)化的特點(diǎn)。目前HPLCMS 連用技術(shù)已經(jīng)成為制藥業(yè)、藥物分析與研制等領(lǐng)域十分重要的分析方法，在環(huán)境分析中也起著重要作用，同時(shí)也是生物化學(xué)和生物技術(shù)大量使用的工具。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL TDLO實(shí)驗(yàn)室建立了完整的LCMS 法檢測(cè)呋喃唑酮代謝物AOZ 及其他代謝物 [19]。Rosa Draisci等 [32]利用HPLC第一章 引 言 10 DAD(光二極管陣列檢測(cè)器)檢測(cè)雞蛋中硝基呋喃類藥物殘留并用HPLCMS進(jìn)行確認(rèn)。Robert Kennedy[21]提出一種用HPLCUV和LCMS 方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中硝基呋喃類抗生素呋喃唑酮。Robert Kennedy[20]利用LCMS方法測(cè)定豬組織中呋喃唑酮的代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)，組織樣品先用甲醇水反復(fù)溶解洗滌并用2硝基苯甲醛衍生化后分析測(cè)定。用此方法在北愛爾蘭豬呋喃唑酮?dú)埩羰录袑?duì)100個(gè)豬腎臟樣品進(jìn)行了測(cè)定，7份濃度在1~5ng/g之間，4份小于1ng/g ，還有1份達(dá)到144ng/g。徐維海等采取LCMS法研究呋喃唑酮及其主要代謝產(chǎn)物AOZ在羅非魚體內(nèi)的殘留規(guī)律，利用該方法對(duì)呋喃唑酮及其代謝物AOZ的檢出限分別為1μg/kg [22]。但是其儀器設(shè)備的購置和運(yùn)行費(fèi)用較高，成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。歐盟 EEC/657/2022指令規(guī)定對(duì)于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到四個(gè)確證點(diǎn)(一個(gè)質(zhì)譜離子為一個(gè)確證點(diǎn))。目前許多國(guó)家已將LCMS/MS方法作為檢測(cè)硝基呋喃類抗生素的代謝物的確證性方法。被分析物被酸性水解從組織中釋放，用2硝基苯甲醛衍生化，利用固相萃取(SPE)將樣品凈化。 [24]也利用LCMS/MS方法對(duì)來自歐洲15個(gè)國(guó)家的1500個(gè)市場(chǎng)購買的豬肉樣品進(jìn)行四種硝基呋喃類抗生素的代謝物殘留的檢測(cè)，方法的定量限分別(AOZ、AMOZ)、(SC)、(AH)，在1500個(gè)樣品中檢測(cè)出12份樣品有代謝物殘留，并得以確證。彭濤等 [11]利用LCMS/MS方法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。~10ng/g范圍內(nèi)，AMOZ回收%~%，%~%，AH回收率為%~%，%~%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)%。~，線性范圍均102 ，線性方程的相關(guān)系數(shù)r ，回收率為 %~%。 分光光度法分光光度法主要是用來測(cè)定動(dòng)物飼料中呋喃唑酮等硝基呋喃類藥物添加劑。此方法測(cè)定簡(jiǎn)便，線性相關(guān)系數(shù)r，試樣回收率在95%~102% 之間。分光光度第一章 引 言 12 法可以判定動(dòng)物性產(chǎn)品中是否存在硝基呋喃類藥物，且該法不需昂貴的儀器與試劑，也沒有復(fù)雜的樣品前處理，操作簡(jiǎn)單，對(duì)于硬件設(shè)備不夠完善的質(zhì)檢部門和生產(chǎn)企業(yè)有較好的推廣及應(yīng)用價(jià)值，但測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度不高，最低檢測(cè)限較高，靈敏度低，不能作為確證性方法?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道的方法也只有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA方法，ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速；缺點(diǎn)是仍不能實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)，而且假陽性率較高。%，板間差異為 %，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，添加回收率試驗(yàn)測(cè)得蝦肉樣本平均回收率為(177。競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)(雙抗體反應(yīng) )。各種硝基呋喃類物質(zhì)代謝物中以AOZ較為典型，以此為例。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。其分析方法：①方法檢測(cè)限和定量檢測(cè)限。添加實(shí)驗(yàn)是在陰性樣品中加入AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液后按樣品前處理和樣品分析進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。測(cè)定了不同批次(n=5)測(cè)試時(shí)添加實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)。另外幾種硝基呋喃類藥物呋喃他酮(AMOZ)、呋喃妥因(AHD)和硝基呋喃腙(SEM) 的藥代動(dòng)力學(xué)與呋喃唑酮相似，共同的亞糠基主鏈代謝很快，而相應(yīng)的側(cè)鏈AMOZ、AHD和SEM結(jié)構(gòu)差異較大，其2NBA衍生物與NPAOZ相比，其IC50均，即以NPAOZ為基準(zhǔn)抗原，%，表明此NPAOZ的蛋白抗體特異性良好 [30]。對(duì)檢測(cè)量大、條件較好的實(shí)驗(yàn)室，可用全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，上述操作中的加樣、孵育、洗板、發(fā)色、終止、測(cè)量、計(jì)算等步驟可全部由全自動(dòng)酶標(biāo)儀來完成。由于硝基呋喃類抗生素代謝迅速，目前國(guó)外報(bào)道的免疫分析方法都是針對(duì)硝基呋喃類抗生素代謝物的ELISA方法。隨后， [30]又建立了蝦組織中呋喃唑酮組織結(jié)合代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)的酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)。IvaDiblikova等 [31]又制備出呋喃唑酮代謝物3氨基2 惡唑烷酮(AOZ)的衍生物的高特異性單克隆抗體并建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，其CCβ 值為 ，與已建立的確證性的LCMS/MS 。目前已有呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒開發(fā)出來，而我國(guó)只能靠引進(jìn)國(guó)外的試劑盒，現(xiàn)在各商檢部門所使用的和各生化試劑公司出售的都是德國(guó)rBiopharm公司生產(chǎn)的試劑盒，其價(jià)格昂貴。高效液相色譜(HPLC) 方法的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化、精確度高、假陽性率低，缺點(diǎn)是儀器昂貴、操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜、成本高、廢棄試劑易造成環(huán)境污染、需要專業(yè)分析人員。ELISA方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、方法種類多、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)假陽性問題。從選擇性、準(zhǔn)確性、靈敏性、穩(wěn)定性、操作難易及費(fèi)用等方面綜合考慮，酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是比較好的殘留檢測(cè)方法，但不能作為確證方法。我國(guó)加入WTO以后，加大了同歐盟、美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家的貿(mào)易往來，促進(jìn)了我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但同時(shí)發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)我國(guó)推行的“綠色壁壘”“技術(shù)壁壘”問題也嚴(yán)重沖擊著我國(guó)對(duì)外出口貿(mào)易。近幾年歐盟、美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)從我國(guó)進(jìn)口的動(dòng)物源性食品都要求嚴(yán)格檢測(cè)硝基呋喃類藥物及其代謝物。附加證明的主要內(nèi)容是：該產(chǎn)品出口前經(jīng)過獸藥殘留特別是氯霉素和硝基呋喃代謝物的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果要符合以下要求:氯霉素；呋喃唑酮(AOZ)；呋喃它酮(AMOZ)；呋喃妥因(AH)；呋喃西林 (SC)。國(guó)外對(duì)硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測(cè)大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù)，第一章 引 言 15 而且趨于成熟，其檢測(cè)限能滿足歐盟的1μg/kg的最低檢測(cè)限量的要求。國(guó)內(nèi)對(duì)硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測(cè)起步較晚，同國(guó)外還有一段差距，起先多數(shù)是檢測(cè)硝基呋喃類原藥化合物，隨著發(fā)達(dá)國(guó)家要求對(duì)從我國(guó)進(jìn)口的動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)各研究機(jī)構(gòu)開始致力于硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)方法的研究，其檢測(cè)限也能滿足歐盟的最低檢測(cè)限量的要求。如果能研制出檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物的試劑盒，使其與同類進(jìn)口試劑盒相比在靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、回收率方面接近或者優(yōu)于進(jìn)口試劑盒，則能彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白。第一章 引 言 16 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 0 第 二 章 實(shí) 驗(yàn) 方 法 原理組織樣品經(jīng)均質(zhì)后經(jīng) HCl 水解，采用 2硝基苯甲醛進(jìn)行衍生化。液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。分液漏斗 250mLEN SPE 柱 LiChroluT，200mg玻璃離心管 15mL第二章 實(shí)驗(yàn)方法 1 試劑與溶液 主要試劑實(shí)驗(yàn)所用到的主要試劑如下：表 22 主要試劑的純度及其生產(chǎn)廠家試劑名稱 純度 生產(chǎn)廠家乙腈 HPLC Grade B＆J Brand 公司甲醇 HPLC Grade B＆J Brand 公司甲酸 分析純 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所乙醇 分析純 濟(jì)南三恩化工有限公司乙酸乙酯 HPLC Grade B＆J Brand 公司正己烷 HPLC Grade B＆J Brand 公司四氯化碳 優(yōu)級(jí)純 天津科密歐化學(xué)試劑公司二甲亞砜 GC Grade SigmaAldich氯化鈉 分析純 齊魯石化公司研究院試劑 廠氫氧化鈉 分析純 天津化學(xué)試劑三廠2硝基苯甲醛 HPLC Grade Fluka 公司鹽酸 分析純 淄博化學(xué)試劑廠無水硫酸鈉 分析純 上海光華科技有限公司水 MΩ 山東檢疫技術(shù)中心 主要溶液的配制實(shí)驗(yàn)所用到的主要溶液的配制如下：第二章 實(shí)驗(yàn)方法 2 表 23 主要溶液及其配制方法溶液名稱及濃度 配制方法鹽酸溶液(1mol/L) 移取 45mL 鹽酸于 500mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度鹽酸溶液（） 移取 125mL，1mol/L 鹽酸溶液于 1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度2硝基苯甲醛溶液（） 稱取 100177。 氯化鈉于 1