【正文】 第三章 結果計算及討論 15 圖 37 衍生化后的硝基呋喃代謝物斷裂方式 標準曲線圖譜及線性范圍 標準曲線圖譜硝基呋喃類代謝物的標準曲線圖譜如下：圖38 呋喃妥因標準曲線圖譜第三章 結果計算及討論 16 圖39 呋喃它酮標準曲線圖譜圖310 呋喃唑酮標準曲線圖譜第三章 結果計算及討論 17 圖311 呋喃西林標準曲線圖譜該加入標準混合溶液的標準曲線的編制基于五個濃度水平，向動物組織及水產品中加入的濃度如下：， 和 ㎏。 內標法定量采用氘代標準(D 5AMOZ、 D4AOZ)和C 13標記標準(C 13AHD、C 13SEM)為內標，4種分析物分別以各自內標定量，減小了外標法回收率的影響，使定量更加準確。本方法采用兔肉、雞肝、魚、腸衣、蝦、魚糜等空白基質進行添加回收試驗，硝基呋喃代謝物在添加水平為 、其平均回收率分別為：AMOZ：% ，%，%；SEM：% ，%，%；AHD ：%， %，% ；AOZ ：%，%，%。 質譜條件的優(yōu)化采用ESI正離子電離模式，通過掃描確定4種組分的母離子MS 2及確定子離子，再采用自動和手動優(yōu)化相結合的方式對每種硝基呋喃類代謝物及內標物子離子進行CE、DP 、EP、 CXP的化合物條件及IE、 CUR、NEB、TEM、GAS 2等離子源條件的優(yōu)化，兼顧各成分的靈敏度的不同而對離子源條件有所偏重，建立了質譜條件，見表32，和4種硝基呋喃代謝物及各自內標的混合標準溶液的監(jiān)測離子圖譜，見圖33，34，35，36 。另外是采用固相萃取柱凈化，實驗了Oasis Max(60mg,3ml Waters)，Oasis HLB(60mg,3ml Waters)，C18(500mg,3ml,)和LiChrolut EN(200mg,3ml,Merck)四種固相萃取柱的凈化效果和回收率，結果發(fā)現(xiàn)，LiChrolut EN柱凈化效果和回收率比另外三種固相萃取柱都較理想。因此，本方法采用鹽酸水解硝基呋喃代謝物與蛋白結合物，用2NBA衍生四種代謝物，第三章 結果計算及討論 2 二個步驟同步進行，見圖32圖 32 結合態(tài)硝基呋喃代謝物的同步水解和衍生化 凈化條件的選擇本文實驗了兩種樣品凈化方式，一是衍生化反應溶液，調pH 后用乙酸乙酯提取兩次，合并乙酸乙酯層氮氣吹干定容。用2硝基苯甲醛(2NBA) 衍生四種代謝物，可以分別形成具有較好特性的衍生物，質譜檢測靈敏度有很大提高。AOZ:)表 31 硝基呋喃代謝物及內標參考保留時間藥物名稱 保留時間/minAMOZAMOZD5 SEMSCA13C15N2 AHDAHD13C3 AOZAOZD4 樣品衍生條件的優(yōu)化四種硝基呋喃代謝物的分子量在102~201之間，在這個質量范圍內質譜背景噪音很大，四種代謝物的電離效率又比較低。SEM:。 總離子流圖和保留時間在上述方法中色譜條件和質譜條件下，目標化合物的標準溶液總離子流圖見圖31，其參考保留時間見表 31。第三章 結果計算及討論 0 第 三 章 結 果 計 算 及 討 論 結果計算內標法定量，按下式計算： 10isisiiCAVXW???式中：——試樣中待測組分殘留量，181。 定量方法以標準物質與內標物質峰面積比為縱坐標，工作溶液濃度（μg/kg）為橫坐標，繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量。測試樣品按以下順序進樣：試劑空白、陰性控制樣（樣品空第二章 實驗方法 6 白）、要確證的樣品、陰性控制樣品（樣品空白）再進樣，最后是陽性控制樣品（質控樣品或添加回收樣品）。按照上述分析條件繪制目標化合物標準曲線。L；（2）質譜條件a) 離子源：電噴霧離子源；b) 掃描方式：正離子掃描；c) 檢測方式：多重反應監(jiān)測；d) 電噴霧電壓：5500V；e) 霧化氣壓力：；f) 氣簾氣壓力： ；g) 輔助氣壓力：；h) 離子源溫度：500℃； 液相色譜串聯(lián)質譜測定、18ng/mL的硝基呋喃代謝物混合標準溶液，、6181。（2）乙酸乙酯提取及 EN SPE 柱凈化（適用于高度渾濁濾液，如蝦、肝、蚌等樣品）將過濾后上清液加入到 LiChrolut EN 柱中， （預先用 3mL 乙酸乙酯、3mL甲醇和 5mL 水進行活化） ，用 3mL 水洗滌，壓干，直至其吸附劑的顏色由棕色變?yōu)槌壬?，?3mL 乙酸乙酯洗脫分析物，洗脫液經氮氣流吹干，殘渣用 1mL流動相溶解，過 濾膜，供液相色譜串聯(lián)質譜測定。而后用1mol/LNaOH或HCl調pH 至~，15℃4500r/min離心 15min，用125mm濾紙過濾上清液。L混合內標工作液，（），8000r/min 勻漿約2min。第二章 實驗方法 4 該步操作適用于測定結合態(tài)的硝基呋喃代謝物，如需測定代謝物總量，可省去該步驟。 分析步驟 洗樣稱取 177。L 至50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻混合內標工作液（100ng/mL） 準確移取混合內標中間液 100181。L 至 50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻混合標準工作液（100ng/mL） 準確移取混合標準中間液 100181。 10mL 三角瓶中，加入 二甲亞砜，混勻30%氯化鈉溶液 稱取氯化鈉 300177。 儀器和設備實驗使用的主要儀器及設備如下：表 21 主要儀器和設備及其型號或容量儀器及設備名稱 型號或容量液相色譜 串聯(lián)質譜儀 Agilent1100， API4000，配有電噴霧離子源離心機 Eppendorf 5810R高速組織搗碎機 IKA T25氮氣濃縮裝置 PIERCE MODEL 1878快速混勻器 IKA MS2固相萃取真空裝置 SUPELCO 公司Eppendorf 移液器 ，均質器 UltraTurrax恒溫振蕩裝置 MEMMER分析天平 Shimadzu SEU210一次性注射式濾器 配有 微孔濾膜聚四氟乙烯離心管 50mL棕色雞心瓶 100mLAgilent HPLC 微量進樣瓶 pH 計 上?？祪x PHS3C 型，測量精度177。水解產物經乙酸乙酯提取，旋轉蒸發(fā)至干，用 %甲酸溶液溶解，較渾濁的樣品，如樣品蝦，可經過乙酸乙酯提取，然后再經 SPE 凈化。因此，研制準確、靈敏、特異性高、方便高效穩(wěn)定的檢測硝基呋喃類藥物代謝物的試劑盒是今后國內檢測硝基呋喃類藥物代謝物殘留方法的目標和方向，值得我們深入研究和開發(fā)。但國內還沒有關于硝基呋喃類藥物代謝物的免疫分析方法的報道，目前國內對試劑盒的使用還主要依靠從國外引進，其價格昂貴。而且國外也已經開發(fā)出呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒。因此加快動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測方法的研究勢在必行。根據歐盟2022/621/EC決議，輸歐的蜂蜜和蜂王漿、養(yǎng)殖水產品、剝殼和/或加工蝦、小龍蝦、腸衣、兔肉必須出具相應的化學殘留檢測證明。發(fā)達國家對進口到他們國家的食品要求檢測的殘留藥物的數(shù)目越來越多，最高限量也越來越低，我國出口的動物性食品退貨的現(xiàn)象越來越多而造成很大損失。高效液相色譜法以及各種聯(lián)用技術是硝基呋喃類抗生素及其代謝物的最終確證性的檢測方法。分光光度法雖然操作簡單，但測定結果準確度不高，靈敏度低，不能作為確證性方法。各種聯(lián)用技術如LCMS、LCMS/MS提高了分析的靈敏度、精確度，降低了檢測限，假陽性率更低，特異性更強，在藥物殘留分析中應用發(fā)展迅速且前景廣闊，但同時也存在同HPLC方法一樣的缺點。第一章 引 言 14 總結從以上對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測方法進行的綜述中可以看出，國內外對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術，另外還有免疫檢測方法和分光光度法等方法。方法同LCMS/MS方法的相關性很好，r。通過分析20個樣品，使用陰性蝦樣品添，%%。2022年，Kevin [30]首先制備出了呋喃唑酮代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)的衍生物的高特異性多克隆抗體，其高靈敏度能夠滿足當前獸藥殘留分析標準，為呋喃唑酮代謝物的免疫分析方法奠定了基礎。對沒有全自動酶標儀的實驗室而言，結果計算時也可用由試劑盒供應商提供的數(shù)據處理軟件經電腦進行處理。在所有恒溫孵育過程中，應避免光線照射，用試劑盒中提供的蓋板蓋住微孔板。不同的添加水平，得到相應的平均回收率和變異系數(shù)RSD；④交叉反應。得到平均回收率和變第一章 引 言 13 異系數(shù)RSD；③方法重現(xiàn)性。根據試劑空白A450值由校準曲線求出相應濃度，以其 3倍標準偏差和10倍標準偏差乘以前處理稀釋倍數(shù)2分別作為檢測限(LOD)和定量檢測限(LOQ)，得到相應的試劑空白對應的濃度，標準偏差SD；檢測限(LOD) ；定量檢測限(LOQ)；②方法回收率和精密度。在450nm 處測量( 選擇參比波長600nm)，吸光度與樣品中的 AOZ濃度成反比。其原理是：將被測樣本中的結合代謝殘留物經水解、衍生形成NPAOZ，其與過氧化物酶標記的NPAOZ競爭結合有限的NPAOZ抗體(競爭性酶免疫分析)，同時此抗體又與包被在微孔板條上針對它的抗體結合，經洗滌除去未結合的NPAOZ后，加入酶反應底物和生色劑到孔中并且孵育，結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色的產物。所涉及的設備有組織搗碎機、微孔板酶標儀(450nm)、離心機、振蕩器、旋轉蒸發(fā)器、磁力攪拌器、微量加樣器、多道移液器、混合器(旋轉后超聲) 等。)%，在試驗濃度范圍內，呋喃唑酮的抗血清與呋喃西林的交叉反應性為43%，與其他藥物未顯示免疫交叉反應性。羅杰、李健 [29]建立了呋喃唑酮間接競爭ELISA檢測法，將呋喃唑酮與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)聯(lián)接，分別作為免疫原及包被原，建立了水產養(yǎng)殖動物組織中呋喃唑酮的ELISA篩選方法，測定的最適范圍為10~100ng/ml，最小檢測限為1ng/ml。 免疫分析法（IA）國內外關于硝基呋喃類抗生素的免疫分析方法的報道很少。BautistaOrdonezJA等 [28]利用分光光度法測定出售的雞飼料中的呋喃西林和呋喃唑酮的濃度，并檢測到飼料中有呋喃西林和呋喃唑酮的存在。廖峰等 [27]利用分光光度法測定飼料中的呋喃唑酮，這種方法是將飼料試樣中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺(DMF)提取出來，使其與苯肼鹽酸溶液反應，產生亮黃色的反應物，再用甲苯萃取后，在440nm處用分光光度計讀取其吸光值，從而進行測定。目前，我國已將液相色譜串聯(lián)質譜法(LCMS/MS)作為測定蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的標準測定方法(GB/)，從2022年8月1日開始實施。余建新等 [26]采用微量化樣品前處理技術，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，電噴霧正離子多反應監(jiān)測方式建立了蜂蜜及水產品中4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時測定的液相色譜一串聯(lián)質譜聯(lián)方法。定量限AMOZ、SC；檢測限AMOZ、AOZ均，SC、。Pascal Mottier等 [25]利用LCMS/MS方法，電噴霧電離(ESI) ，內標法定量檢測肉中4種硝基呋喃類抗生素的代謝物，~，~，低于歐盟規(guī)定的1μg/kg 的最低檢測限量的要求。四種硝基呋喃類抗生素代謝物第一章 引 言 11 AOZ、 AMOZ、SC 、定量限分別是、測定響應值的線性范圍從檢測限到 800ng/g之間。Alexander Leitner等 [23]提出用LCMS/MS方法同時分析動物肌肉組織中四種硝基呋喃類抗生素的代謝物的方法。顯然，并非所有的殘留檢測實驗室都具備HPLCMS/MS 儀器條件 [45]。（2）液相色譜串聯(lián)質譜法(LCMS/MS)最近幾年用于檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的LCMS/MS方法發(fā)展迅速，它是一種靈敏度更高、選擇性更好、特異性更強的一種方法，歐盟目前認為HPLCMS只能用于對硝基呋喃代謝產物進行篩選實驗，對檢出的陽性結果必須再用LCMS/MS 進行確證。由此可見LCMS 是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強、快速的分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。目前，HPLC、LCMS 相關聯(lián)的NPAOZ 提取方法已經得到改良，并通過一系列的加標樣品研究得以驗證。肝臟和肌肉組織的檢測限為10ng/g，回收率大于80%。在溶解提取物用鋁土柱凈化后，用HPLCUV篩選可能含有呋喃唑酮的樣品，LCMS 方法用來確定證實陽性樣品。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用HPLCMS方法檢測限分別為、。HorneE 等進一步對該方法進行改進，利用 SPE簡化了衍生后的呋喃唑酮代謝物NPAOZ的提取過程，再用LCMS 法進行定性分析，對檢測豬肝中呋喃唑酮代謝物AOZ的不同方法進行比較研究，表明利用HPLC法和LCMS法測定 AOZ的結果基本相同 [20]。近幾年國內外采用HPLCMS對各種藥物及其代謝物的研究取得了一定的進展。LCMS 法可以利用待測分子的結構來定性，可以排除酶聯(lián)免疫方法和HPLC法檢測的假陽性結果，用以確證檢測結果。近些年來，高效液相色譜配合質譜技術(LCMS)測定硝基呋喃類代謝物在動物組織中的殘留越來越多被采用，與用紫外檢測器的檢測方法比較，質譜檢測器技術具有定性、定量準確，抗干擾能力強，檢測限低，測定快速等特點 [17]。 聯(lián)用技術分析法（1）液相色譜質譜法(LCMS