【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 et）（Thr，Leu2）GlyValSerGluArg]。這跟編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的mlr6806基因同源性很高。圖13：根據(jù)emlr6806 cDNA推測(cè)的氨基酸序列圖Fig13 Nucleotide sequence of cDNA encoding pyridoxamine–pyruvate aminotransferase and its deduced amino acid sequence2006年，Yu[52]等將重組的PM丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶基因?qū)隡esorhizobium loti細(xì)胞表達(dá)，超聲破碎得到粗酶液，經(jīng)過30–70%（NH4）2SO4鹽析、透析、離子交換層析（QA52 column）、疏水層析（butylToyopearl column）等步驟對(duì)酶進(jìn)行純化，并對(duì)其動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)PM丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶對(duì)底物PM和丙酮酸的米氏常數(shù)（Km） 177。 ， 177。 mM。 煙草的組織培養(yǎng)和煙草體內(nèi)VB6的研究進(jìn)展組織培養(yǎng)把高等植物細(xì)胞全能性表達(dá)與遺傳操作相結(jié)合，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有巨大潛力，可以為常規(guī)的植物改良程序提供一種新的手段，從而使很多傳統(tǒng)方法難以解決的問題迎刃而解，更多、更快、更好地創(chuàng)造出各種農(nóng)作物和園藝植物的新品種、新類型和新種質(zhì)。在組織培養(yǎng)技術(shù)研究迅速發(fā)展的今天，在利用原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合成體細(xì)胞雜種、花藥培養(yǎng)育種等方面，煙草一直是重要的實(shí)驗(yàn)材料。在長(zhǎng)期研究中，對(duì)煙草髓組織、葉組織及其愈傷組織的器官分化，已經(jīng)積累了大量資料[54]。作為一種理想的實(shí)驗(yàn)材料，煙草已經(jīng)在植物改良中發(fā)揮了重要作用，而且隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，必將能發(fā)揮更大作用。朱生偉[55]等將5 mm5 mm左右的煙草葉片接種到2/3 MS+BA 05 mg/L+IAA 01 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，從外植體的邊緣產(chǎn)生芽點(diǎn)，4周后分化出大量叢生芽，繼續(xù)培養(yǎng)到6周后，當(dāng)芽長(zhǎng)23 cm時(shí)，轉(zhuǎn)移到2/3MS+BA mg/L+NAA 1 mg/L的培養(yǎng)基中分化出根，形成完整的再生植株。王煜[56]等:在一定的培養(yǎng)條件下， mg/L NAA的MS基本培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)出愈傷組織。 mg/L NAA+ mg/L 6BA的MS培養(yǎng)基上能分化出芽。 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基中能形成根. 施和平[57]等煙草葉片外植體在MS+2，4D mg/L+ mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，產(chǎn)生絮狀疏松的淺黃綠色的愈傷組織，30 d后開始從愈傷組織表面分化產(chǎn)生幼芽，60 d后平均每塊愈傷組織產(chǎn)生30棵幼芽。 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上形成根，并得到完整植株煙草是一種經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要的作用。同時(shí)它也是研究細(xì)胞脫分化和再分化的較好材料，因而學(xué)者們對(duì)其進(jìn)行了不少研究。由于這些研究多取材于自然條件下生長(zhǎng)的煙草，因而對(duì)離體培養(yǎng)條件適應(yīng)性較差，致使完成細(xì)胞脫分化和再分化形成再生植株的時(shí)間較長(zhǎng)，頻率較低，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的研究，因此在非豆科植物的人工誘發(fā)固氮方面，它也可能是一種較為理想的材料。VB6是一種潛在的單線態(tài)氧的淬滅劑，它的淬滅能力可比VC和VE，甚至比后兩者更高[58]，在1995年，一篇報(bào)告指出：用水楊酸和乙烯利處理橡膠樹后，化學(xué)劑誘導(dǎo)植物導(dǎo)致植物抗病防御反應(yīng)[59]，導(dǎo)致植物體內(nèi)的PDX1基因拷貝數(shù)增加，這表明VB6可能在植物的防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。植物在遭受病原體攻擊時(shí)，植物自身將產(chǎn)生活性態(tài)氧（AOS），例如超氧陰離子，過氧化氫，羥基自由基，一氧化氮等?；钚匝踉谥参镌馐懿≡w攻擊時(shí)發(fā)揮重要作用。這些活性氧扮演著作為抗菌劑，在構(gòu)建細(xì)胞壁保護(hù)墻作為底物，作為激活防御體系信號(hào)傳導(dǎo)分子的角色。但是活性態(tài)氧（AOS）的產(chǎn)生必須受到嚴(yán)格的控制，因?yàn)檫^度的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[60，61]。因此AOS需要維持在一定的水平以抵擋病原體在感染部位的侵襲和刺激植物產(chǎn)生防御反應(yīng)。然而保持活性氧水平較低的地區(qū)不受病原體侵害來保持組織完整性和生存能力。為了讓這種植物的微調(diào)發(fā)揮作用，植物利用AOS來調(diào)控相關(guān)酶的活性。用水楊酸和茉莉酮酸酯處理煙草或者煙草受到病原體侵害時(shí)，其VB6合成基因隨之發(fā)生調(diào)控，在煙草發(fā)生防御應(yīng)答的過程中，煙草體內(nèi)的PN含量增加。2引言雖然植物是自然界VB6的主要制造者，但是植物體內(nèi)VB6的研究開展較晚，VB6的代謝機(jī)制和特殊生理機(jī)制還有待研究。煙草作為一種模式植物，也成為VB6研究的實(shí)驗(yàn)材料。2005年Denslow等率先從煙草克隆出編碼PLP合成酶的PDX1和PDX2基因，還發(fā)現(xiàn)煙草遭遇病原體侵染后體內(nèi)的VB6含量增加[62]。另一方面，煙草體內(nèi)VB6的存在型態(tài)還未見報(bào)道。VB6的基本類型有PN、PM和PL，磷酸酯型有PNP、PMP和PLP，在植物體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)有數(shù)種PN的糖和氨基酸衍生物。目前還缺乏植物體內(nèi)各種VB6化合物存在形態(tài)和動(dòng)態(tài)變化的研究報(bào)道。煙草植物的根、莖、葉等組織中各種VB6化合物的存在形態(tài)和動(dòng)態(tài)變化是其代謝途徑、生理機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)。對(duì)哺乳動(dòng)物而言，細(xì)胞中游離存在的PLP池被維持在一個(gè)較低的水平，PL激酶和PNP/PMP氧化酶受到調(diào)控，以致在細(xì)胞需要時(shí)，PLP能夠及時(shí)產(chǎn)生。這是因?yàn)镻LP含有強(qiáng)活潑性的醛基，幾乎能與細(xì)胞中所有的親核試劑和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。VB6是一種潛在的生物抗氧化劑，可以保護(hù)植物免受多種環(huán)境脅迫因子的影響，其作用機(jī)制就成為一個(gè)很重要的問題。受環(huán)境脅迫因子的作用后，植物體內(nèi)VB6化合物（特別是PLP）的抗逆性應(yīng)答分析有助于揭示植物體內(nèi)VB6的抗逆作用機(jī)制。另外有關(guān)植物體內(nèi)相關(guān)代謝途徑的還有待進(jìn)一步研究，有利于闡述植物的的抗逆應(yīng)答。 安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（KJ2010A116）3材料與方法煙草品種為云煙21，在營(yíng)養(yǎng)土上生長(zhǎng)的煙草，MS培養(yǎng)基上組培的煙草。高效液相色譜：Waters 600配有2475熒光檢測(cè)器色譜柱：Hamp。E XP ODSA 5181。 120A（）精密電子天平：瑞士梅特勒托利多公司高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司渦旋器：上海滬西分析儀器廠有限公司PHS4CT型酸度計(jì)：上海康儀儀器有限公司恒溫振蕩水槽：上海智城分析儀器有限公司APU175G型超純水機(jī) 艾科浦，重慶頤洋鹽酸吡哆醇（PNHCl）、鹽酸吡哆醛（PLHCl）、鹽酸吡哆胺（PM2HCl）、磷酸吡哆胺鹽酸鹽（PMPHCl）和PLP購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。高氯酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和磷酸和MS培養(yǎng)基的構(gòu)成試劑2，4D、6芐氨基腺嘌呤（6BA）、萘乙酸（NAA）、蔗糖、瓊脂粉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。色譜級(jí)純乙腈、甲醇購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；水為超純水，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 MS培養(yǎng)基的配制 母液的配置：MS培養(yǎng)基由大量元素，微量元素，鐵鹽，有機(jī)成分，生長(zhǎng)素和激素類以及提供碳源的蔗糖和起凝固作用的瓊脂粉組成，本實(shí)驗(yàn)用的配方如下：表1 MS培養(yǎng)基的配方母液名稱化合物名稱配方規(guī)定量（mg/L）貯備液的倍數(shù)配置母液稱取量/mg母液體積/ml配一升培養(yǎng)基時(shí)取母液量/ml大量元素NH4NO320 100050KNO3KH2PO4微量元素KI20010005H3BO3鐵鹽200100 5有機(jī)成分肌醇200100 5煙酸1000鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸生長(zhǎng)素與激素類2，4D5010100206BA200105蔗糖30000瓊脂粉7500配置各母液時(shí)的注意以下幾點(diǎn)：1．大量元素母液配置時(shí)，以免產(chǎn)生CaSO4沉淀2．有機(jī)成分母液時(shí)，肌醇要單獨(dú)配置，因?yàn)樗灰兹芙忤F鹽，生長(zhǎng)素與激素類母液要保存于棕色瓶中3．2，4D與6BA的配置方法時(shí)先將其溶于少量的乙醇中，再用純水定容（2）照配方中的量將各母液加到大燒杯中，然后用純水定容（3）加蔗糖：稱好蔗糖，加到溶液中，溶解（4）調(diào)pH值：（5）分裝溶液：將溶液分裝到500毫升的錐形瓶中，每瓶中裝250毫升，（6）滅菌：121度，（7）分裝培養(yǎng)基：在超凈工作臺(tái)中將滅菌過的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿中，用封口膠封住培養(yǎng)皿四周. 無菌體系的建立：滅菌的方法主要由以下幾種：（1）烘烤法：150度烘烤23h，適合培養(yǎng)皿，鑷子，剪刀等，用報(bào)紙抱住培養(yǎng)皿，（2）錫箔紙抱住鑷子，剪刀等；（3）濕熱滅菌：121度，（4）紫外燈照射：超凈工作臺(tái)和恒溫培養(yǎng)箱使用之前，開紫外燈照射20min70%酒精：用于超凈工作臺(tái)、手、其他器物表面和外植體的滅菌，特點(diǎn)時(shí)滲透組織能力強(qiáng)，在外植體滅菌時(shí)時(shí)間要短；（5）%升汞：毒性較強(qiáng)，適用于外植體的滅菌，特點(diǎn)時(shí)殘留量較多，須要無菌水清洗35次； 煙草組培體系的建立采用組培的方式培育煙草幼苗。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、幼芽增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基分別為：MS + 2，4D mg/L + 6BA mg/L、MS + 6BA mg/L + NAA mg/L、MS + NAA mg/L。上述培養(yǎng)基均添加3%%瓊脂。培養(yǎng)溫度25177。2℃，光照14 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx。 煙草的栽培莖高約5 cm的幼苗轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)土上開始實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)培養(yǎng)基為不含PN的MS培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)土為泥炭蘚：蛭石：珍珠巖=1:1:1。試驗(yàn)時(shí)間為3周，每隔7天抽樣分析煙草體內(nèi)的VB6. 煙草的處理外源添加三級(jí)濃度10181。g/ml，30181。g/ml 100181。g/ml PM，PL，PN在長(zhǎng)有莖高約5 cm幼苗的MS培養(yǎng)基中，于4天，8天分別收集樣品，放于20℃冰箱，備用于煙草VB6吸收機(jī)制的研究。外源添加100181。g/ml PM，PL，PN在長(zhǎng)有莖高約5 cm幼苗的MS培養(yǎng)基中，試驗(yàn)時(shí)間為3周，每隔7天抽樣放于20℃冰箱，用來分析煙草體內(nèi)的VB6和相關(guān)代謝酶活性的變化。 VB6標(biāo)準(zhǔn)試劑的配制參照張劍韻等人的方法[63]，略做改動(dòng)。精確稱取VB6標(biāo)準(zhǔn)品：PMP mg，PM mg，PLP mg，PL mg，PN mg；用不含乙腈的流動(dòng)相A溶解定容50 ml后稀釋成各級(jí)使用濃度。 VB6的色譜分析條件分析裝置為Waters 600高效液相色譜儀，配有2475熒光檢測(cè)儀。色譜柱為Hamp。E公司的XP ODSA 5 μm 120 A（250 mm），柱溫保持30℃。流動(dòng)相A（分析用）：1%（V/V）CH3CN 25 mmol/L KH2PO4 25?mmol/L NaCLO4（）；流動(dòng)B（色譜柱清洗用）：10%（V/V）CH3CN 25 mmol/L KH2PO4 25?mmol/L NaCLO4（）； mL/min。熒光檢測(cè)器調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)290 nm， nm，進(jìn)樣量均為5 181。L。洗脫程序?yàn)锳（25min）B（15min） A（25min）。 煙草組織中VB6的提取 g樣品用液氮研磨后轉(zhuǎn)入5 mL離心管，按1/3的比例加入1 mol/L的高氯酸后充分渦旋，離心（8 000 r/min，4℃）20 min去除蛋白質(zhì)；取上清加入等體積的1 mol/L磷酸緩沖液（）后再次離心（8 000 r/min，4℃）10 min去鹽。 181。m微孔濾膜過濾后用于HPLC分析。為避免VB6的光分解，以上操作均在暗室中進(jìn)行。取煙草葉片組織10g加液氮研磨， 5 mmol/L三乙醇胺 （TEA） 緩沖液 （pH ） ，混合樣即為粗酶液。（1）PL激酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系3ml，.， mM PL ， mM ATP， mM Zncl2，70 mM磷酸緩沖液（）反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)。（2）PNP/PMP氧化酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系3ml， ml， mM PMP， mM FMN ，100mM TrisHcl 100 mM KPO4（）反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。（3）PLP磷酸酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系3ml， ml， mM PLP ，4 mM Mgcl2，50 mM TEA緩沖液（）反應(yīng)時(shí)間10min。（4）PMP磷酸酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系3ml， mM PMP:，4 mM Mgcl2，50 mM TEA緩沖液（）反應(yīng)時(shí)間10min。（5）PL還原酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系3ml， mM PL， mM NADPH ，100 mM MOPS/KOH緩沖液（）反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。（6）PM丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系3ml，3mM PM，3mM丙酮酸，100mM borate/KOH緩沖液（pH11）反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。酶促反應(yīng)在暗室中 37 ℃的條件下進(jìn)行 ，終止反應(yīng)采用3 mol/L HClO4 mL。對(duì)照均為先將酶液煮沸15min充分滅活。反應(yīng)生成物的分析定量采用 HPLC分離和熒光定量法。+（2%苯肼） 60下反應(yīng)20min后在410nm下比色 。酶活定義為：每分鐘每克鮮葉組織催化生成產(chǎn)物的nmol數(shù)。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析取煙草幼嫩葉片用自來水充分洗凈，經(jīng)75%酒精消毒30 s、%升汞溶液浸泡8 min、無菌水沖洗5～6次后，～ cm2的小方塊轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。10 天后，葉片外植體卷曲、增厚、膨脹，20 天后外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的愈傷組織，30 天后從葉片外植體產(chǎn)生的疏松愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點(diǎn)。將帶芽點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到幼芽增殖培養(yǎng)上培養(yǎng)25 天后，從愈傷組織上分化出幼芽；當(dāng)芽長(zhǎng)為2～3 cm時(shí)切取幼芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)35 天長(zhǎng)出約2 cm的根。 圖4