【文章內(nèi)容簡介】 恒溫水浴鍋：37℃～100℃。 PCR儀。 電泳儀。 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）。 冷凍離心機(jī)。 采樣管或商品化采樣拭子。 小型離心管。 微量加樣器：1μL～1000μL。 吸頭（與微量加樣器匹配）。 漩渦儀。 微波爐。3 培養(yǎng)基和試劑 標(biāo)準(zhǔn)菌株：沙門氏菌CVCC 541 DNA Maker Taq DNA 聚合酶 dNTP 瓊脂糖 5TBE緩沖液三羥甲基氨基甲烷（Tris） 硼酸 EDTA（） 20mL加純凈水至 1000mLTAEbuffer三羥甲基氨基甲烷（Tris）242g加純凈水至 1000mL invA基因引物上游為5′GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA3′下游為5′TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C 3′ 運送培養(yǎng)基。 沙門氏菌顯色瓊脂。 沙門氏菌陽性血清。 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）。 四硫磺酸鹽增菌液（TTB）。 核酸染料。 氯化鈉。4 沙門氏菌分離與鑒定程序沙門氏菌分離與鑒定程序見圖2。動物腸道或其他拭子運送培養(yǎng)基接種SC增菌液，36177。1℃，培養(yǎng)18~24h；或TTB增菌液，42177。1℃，培養(yǎng)22~24h接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基挑取沙門氏菌可疑菌落純化生化鑒定PCR鑒定沙門氏菌沙門氏菌恥諤銪滅縈歡煬鞏鶩錦聰櫻鄶燈鰷軫。圖2 沙門氏菌的分離和鑒定程序 采樣 選擇養(yǎng)殖場或屠宰場，用滅菌棉拭子采集動物腸道或泄殖腔（肛門）樣品，置入運送培養(yǎng)基中，保存時間不超過48小時。鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫搖飭緡釷鯉憮。 沙門氏菌的分離 將拭子置于SC增菌液，36℃177。1℃培養(yǎng)18～24h 或TTB增菌液，42℃177。1℃培養(yǎng)22～24h。碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞鷥膠據(jù)實鰹贏。 將菌液混勻，接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，36℃177。1℃培養(yǎng)22～24h。 挑取沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上紫色可疑菌落，接種營養(yǎng)瓊脂平板，36℃177。1℃培養(yǎng)16～24h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖輛塤鵜蘞鰱幟。 沙門氏菌的鑒定 對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進(jìn)行生化鑒定，（PCR）鑒定。氬嚕躑竄貿(mào)懇彈瀘頷澩紛釓鄧鰲鱺貼。必要時，用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行血清型鑒定。 PCR法鑒定 PCR模板的制備用接種環(huán)從營養(yǎng)瓊脂上挑選16～24h的純培養(yǎng)物，12000r/min離心2min，棄上清。，懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷卻后以12000r/min離心2min，取上清液為PCR模板。釷鵒資贏車贖孫滅獅贅慶獷緞瑋鱘將。 PCR反應(yīng)體系的配制 根據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配制PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增片段長度約284 bp。 PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s, 64℃退火30s，72℃延伸30s, 30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，同時設(shè)立陰性和陽性對照。 慫闡譜鯪逕導(dǎo)嘯畫長涼馴鴇撟鉍鲞謠。 電泳 %瓊脂糖凝膠板的制備，TBE（或1TAE）緩沖液中，加入核酸染料，依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子，瓊脂糖溶化后混勻倒入在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，TBE（或1TAE）緩沖液淹沒膠面。諺辭調(diào)擔(dān)鈧諂動禪瀉類謹(jǐn)覡鸞幀鮮奧。 加樣取10181。LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和3181。L上樣緩沖液混勻后加入加樣孔，每次電泳時，各做一個陽性對照和陰性對照。 電泳條件電壓110V，電泳時間30min。 結(jié)果判定電泳結(jié)束后，取出膠塊置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。如果某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶與沙門氏菌陽性對照的條帶在一條直線上，即條帶與加樣孔的距離相同，而陰性對照無此條帶，則該樣品分離到的菌株可初步判定為沙門氏菌，必要時可通過測序來進(jìn)一步確證。嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈癱懇跡見鮫請。三、動物源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用于耐藥性測定的動物源金黃色葡萄球菌的分離和鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶、動物組織和上呼吸道中金黃色葡萄球菌的分離和鑒定。2 設(shè)備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 冰箱：0℃～4℃和20℃。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。1℃和42℃。 顯微鏡：10～100。 商品化或自制采樣管。 無菌離心管。3 培養(yǎng)基和試劑 標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213 %氯化鈉肉湯10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 新鮮兔血漿或商品用凝固酶試驗兔血漿 %過氧化氫液 %無菌生理鹽水4 金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序見圖3。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基可疑菌落營養(yǎng)瓊脂生化鑒定1mL牛奶+9mL %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯，上呼吸道拭子直接放入肉湯中，混勻血漿凝固酶試驗觸酶試驗陽性扁桃體、動物組織 金黃色葡萄球菌圖3 金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機(jī)庫圓鍰緘鶚鱭圓。5 操作步驟 采樣：到已選定的奶牛養(yǎng)殖場，現(xiàn)場采牛奶置入滅菌試管中，0℃～4℃保存，不超過48h。、發(fā)病動物組織和上呼吸道拭子：無菌操作取發(fā)病動物組織和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入滅菌試管中，0℃～4℃保存不超過48h。鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞闋簣擇睜鮪謅。 吸取1mL牛奶樣品或?qū)⑸虾粑朗米又潦⒂?0mL %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯中，振蕩混勻。紂憂蔣氳頑薟驅(qū)藥憫騖覲僨鴛鋅鮚嗚?！?77。1℃培養(yǎng)18～24 h。%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。穎芻莖蛺餑億頓裊賠瀧漲負(fù)這惻鮭觶。 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到顯色培養(yǎng)基平板上，無菌操作將發(fā)病動物組織直接劃線，36℃177。1℃培養(yǎng)24～48h。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻減棲綜訴鮐巹。 挑取可疑菌落。用營養(yǎng)瓊脂純化一代，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。 金黃色葡萄球菌的鑒定 將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行觸酶試驗，應(yīng)為陽性。將新鮮純化、經(jīng)觸酶試驗陽性待檢細(xì)菌單個菌落，懸浮于5mL滅菌生理鹽水，按照生化鑒定試條使用說明書操作，37℃培養(yǎng)18～24h后判讀結(jié)果。銚銻縵嚌鰻鴻鋟謎諏涼鏗穎報嚴(yán)鮑蠅。 挑取顯色平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂平板，36℃177。1℃培養(yǎng)18～24h。將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24h以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行觸酶試驗，應(yīng)為陽性。擠貼綬電麥結(jié)鈺贖嘵類羋罷鴇竇鮒鑿。 新鮮兔血漿制備：，加蒸餾水100mL,溶解后過濾，裝瓶，121℃高壓滅菌15min。%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置 (或以3000r/min 離心30 min)，使血液細(xì)胞下降，即可得血漿。賠荊紳諮侖驟遼輩襪錈極嚕辮鏢鱸蕆。 　 mL，放入小試管中，再加入BHI ～ mL，振蕩搖勻，置36℃177。1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗。塤礙籟饈決穩(wěn)賽釙冊庫麩適緄撾鲅傯。四、動物源彎曲桿菌的分離與鑒定方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的分離鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于糞便拭子和盲腸內(nèi)容物中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的分離與鑒定。2 設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌與培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。 采樣管 采樣棉拭子 生物安全柜 恒溫培養(yǎng)箱: 25℃177。1℃，36℃177。1℃，42℃177。1℃。 恒溫水浴鍋：37℃～100℃。：5%氧氣+10%二氧化碳+85%氮氣，或商品化微需氧包。 顯微鏡：10～100。：≥12000r/min。：。 微量加樣器：1μL～1000μL。 吸頭（與微量加樣器相匹配） 微波爐 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）培養(yǎng)基和試劑 質(zhì)控菌株：空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 33560） DNA Marker 引物及擴(kuò)增片段長度 引物空腸彎曲菌：上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’，下游 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’，擴(kuò)增片段長度為 773bp。裊樣祕廬廂顫諺鍘羋藺遞燦擾諗魴莖。結(jié)腸彎曲桿菌：上游：AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC，下游：TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC，擴(kuò)增片段長度為364bp。倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驁絛鯛鱧俁魷親。 運送培養(yǎng)基 彎曲菌選擇性（CCD）培養(yǎng)基 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基 生理鹽水 10 PCR 緩沖溶液Ⅱ 氯化鎂溶液（25mM） Taq 聚合酶（） dNTPs（2mM） 瓊脂糖 50TAE緩沖液：將242gTris堿， EDTA（），加純水至1000mL。綻萬璉轆娛閬蟶鬮綰瀧恒蟬轅紗魚臚。1TAE緩沖液： 臨用時將50TAE緩沖液1份加蒸餾水49份，混勻即可。 上樣緩沖液 溴化乙錠溶液（10mg/mL）：稱取1g溴化乙錠溶于100mL水中，用磁力攪拌器攪拌數(shù)小時直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。驍顧燁鶚巰瀆蕪領(lǐng)鱺賻驃弒綈閶魎齠。 礦物油4 空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的分離與鑒定程序空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的分離與鑒定程序見圖4。動物盲腸或者糞便拭子CCDA培養(yǎng)基42177。1℃，微需氧條件下培養(yǎng)24~48h挑取彎曲桿菌可疑菌落純化生化鑒定PCR鑒定空腸彎曲桿菌或結(jié)腸彎曲桿菌瑣釙濺曖惲錕縞馭篩涼貿(mào)錒戧晉魘繅。圖4 彎曲桿菌的分離和鑒定程序5 操作步驟 分離與純化 分離將新鮮或者運送培養(yǎng)基中的糞便拭子或盲腸內(nèi)容物在CCD培養(yǎng)基上涂抹，用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)與涂抹處垂直劃線。鎦詩涇艷損樓紲鯗餳類礙穡鰳責(zé)髕鵲。將上述接種后的平板置于42℃177。1℃恒溫培養(yǎng)箱中，在微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h。觀察24h培養(yǎng)與48h培養(yǎng)的瓊脂平板上的菌落形態(tài)。挑取灰色、濕潤、凸起、光滑圓潤、邊緣整齊的可疑單菌落。櫛緶歐鋤棗鈕種鵑瑤錟奧傴輥刪髖綠。對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進(jìn)行生化鑒定，并進(jìn)行結(jié)果判定?！≒CR）鑒定。轡燁棟剛殮攬瑤麗鬮應(yīng)頁諳絞綽髏鱉。（PCR）鑒定，12000r/min離心2min，棄上清。，懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷卻5min后，12000r/min(4℃)離心2min，取上清作為PCR模板。峴揚斕滾澗輻灄興渙藺詐機(jī)憒頇驤經(jīng)。 PCR反應(yīng)體系根據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配制PCR反應(yīng)體系。同時設(shè)立陰性和陽性對照。 PCR反應(yīng)條件采用的PCR反應(yīng)條件見下表。PCR反應(yīng)程序表5min, 94℃1min,94℃，1min,64℃，1min,72℃，2*1min,94℃，1min,62℃，1min,72℃，2*1min,94℃，1min,60℃，1min,72℃，2*1min,94℃，1min,58℃，1min,72℃，2*1min,94℃，1min,56℃，1min,72℃，2*1min,94℃，1min,54℃，1min,72℃，30*10min,72℃ 電泳 %瓊脂糖凝膠板的制備，TBE緩沖液（或1TAE緩沖液）中。加熱融化后加5μL（10mg/mL）溴化乙錠，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，TBE緩沖液（或1TAE緩沖液）淹沒膠面。詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁靈韜鰍櫝驥鱭。 加樣取10181。LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和3181。L上樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳加陽性對照和陰性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物各1孔作為對照。則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧華縉輅贊驏紆。 電泳條件電壓110V，電泳時間40min。 結(jié)果判定