【正文】 后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，TBE緩沖液（或1TAE緩沖液）淹沒膠面。 加樣取10181。L上樣緩沖液混勻后加入一個(gè)加樣孔。則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧華縉輅贊驏紆。 結(jié)果判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。必要時(shí)，可以通過測序來進(jìn)一步確證。本方法適用于各種動(dòng)物中屎腸球菌和糞腸球菌的分離與鑒定。 冰箱：2℃～4℃和20℃。1℃。 顯微鏡：10～100。 生化鑒定卡或商品化試條。 微量加樣器：1μL～1000μL。3 培養(yǎng)基和試劑 運(yùn)送培養(yǎng)基。4 屎腸球菌和糞腸球菌分離與鑒定程序 屎腸球菌和糞腸球菌分離與鑒定程序見圖5。1℃，培養(yǎng)18~24h；挑取腸球菌可疑菌落純化生化鑒定屎腸球菌或糞腸球菌鰓躋峽禱紉誦幫廢掃減萵輳慘纈騾窺。 屎腸球菌和糞腸球菌的分離 拭子接種于腸球菌顯色瓊脂平板，36℃177。1℃培養(yǎng)16～18h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。必要時(shí)，采用腸球菌標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行血清型鑒定。 本方法適用于畜禽源魏氏梭菌的分離與鑒定。3 培養(yǎng)基和試劑 運(yùn)送培養(yǎng)基 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG） 胰胨亞硫酸鹽環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂 腦心浸液（BHI）瓊脂 綿羊血瓊脂平板 P15B D環(huán)絲氨酸 滅菌液體石蠟 無菌生理鹽水 緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基 硝酸鹽還原試劑 乳糖明膠培養(yǎng)基 含鐵牛乳培養(yǎng)基 革蘭氏染色液 硝酸鹽還原試劑 試劑甲：對氨基苯磺酸溶液，試劑乙：α萘酚乙酸溶液。 1TAE緩沖液臨時(shí)用是將50TAE緩沖液1份加蒸餾水49份，混勻即可。圖6 魏氏梭菌分離與鑒定程序5 操作步驟 采樣：做好采樣準(zhǔn)備后赴養(yǎng)殖場或屠宰廠，針對擬采樣的健康畜/禽或發(fā)病畜/禽個(gè)體，用無菌棉簽插入其肛門或泄殖腔采集糞便，采集的健康畜/禽與發(fā)病畜/禽的樣品比例為1:1，置于運(yùn)送培養(yǎng)基。：做好采樣準(zhǔn)備后赴養(yǎng)殖場或屠宰廠，針對擬采樣的健康畜/禽或發(fā)病畜/禽，用無菌棉簽蘸取其排泄的新鮮糞便（用滅菌鑷子扒開糞便表皮，蘸取內(nèi)部糞便），置于運(yùn)送培養(yǎng)基。 腸道內(nèi)容物：做好采樣準(zhǔn)備后赴養(yǎng)殖場或屠宰廠，針對擬采樣的屠宰或剖檢畜/禽，無菌剪取其正常/異常腸段（盲腸或結(jié)腸段），結(jié)扎后置于無菌自封袋。，做好標(biāo)注后立即置于帶有冰袋的保溫設(shè)備中，轉(zhuǎn)運(yùn)至試驗(yàn)室（轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間不超過48h）。 增菌和分離純化（1）棉拭子和糞便樣品：從盛有樣品的運(yùn)送培養(yǎng)基中吸取液體200μL，放入含2mL FTG的5mL離心管中，加入滅菌液體石蠟封住液面，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h進(jìn)行增菌；咼鉉們歟謙鴣餃競蕩賺趲為練濺騙閻?，撝C齷蘄賞組靄縐嚴(yán)減籩諏戀鄰驂灝。瓊脂凝固后，再加10 mL 冷卻至50 ℃的TSC均勻覆蓋于表層。挑取黑色且有乳白色暈圈的單菌落接種于綿羊血瓊脂平板上，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，挑取有溶血環(huán)的菌落。麩肅鵬鏇轎騍鐐縛縟糶爾攤鱘嫗騅鐳。 納疇鰻吶鄖禎銣膩鰲錟顫階躦萵騍潤。魏氏梭菌為革蘭氏陽性粗短桿菌，呈紫色，有時(shí)可見芽孢體。已純化的菌株可用于后續(xù)的生化鑒定或PCR鑒定試驗(yàn)。 牛乳洶涌發(fā)酵試驗(yàn)取生長旺盛的FTG 培養(yǎng)液1 mL 接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃177。5 h 內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。 滅噯駭諗鋅獵輛覯餿藹猙廚憮犧駿灃。在透射光下檢查細(xì)菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動(dòng)力。 mL mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。魏氏梭菌無動(dòng)力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。（2）乳糖發(fā)酵明膠液化試驗(yàn) 用接種環(huán)（針）取FTG 培養(yǎng)液穿刺接種乳糖明膠培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，觀察結(jié)果。將試管于5 ℃左右放置1 h，檢查明膠液化情況。魏氏梭菌能發(fā)酵乳糖，使明膠液化。（PCR）鑒定（1）PCR模板制備 ，按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作指南提取菌株基因組DNA，作為PCR模板。（2）PCR反應(yīng)體系配制 總體積為50μL，其中PCR Taq DNA聚合酶25μL，16S rDNA通用引物上、下游各1μL，模板1μL，dd H2O 22μL，設(shè)立陰性與陽性對照。（3）PCR反應(yīng)條件 94℃預(yù)變性 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃1min30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。視絀鏝鴯鱭鐘腦鈞欖糲僉爾魷癆駱鈐。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。（5）結(jié)果判定 將電泳后顯示條帶的PCR產(chǎn)物送去測序公司進(jìn)行16S rRNA測序，將返回的測序結(jié)果用NCBI上的Blast進(jìn)行比對分析。 菌種保存將鑒定完畢并確認(rèn)是魏氏梭菌的菌株接種于綿羊血瓊脂平板上，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，將板子上的菌落全部刮下，置于含有500μL ，和500μL甘油（60%）充分混勻，放入80℃超低溫冰箱保存。七、副豬嗜血桿菌的分離與鑒定方法范圍本方法規(guī)定了動(dòng)物源副豬嗜血桿菌的分離與鑒定方法。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下。 恒溫培養(yǎng)箱：37177。 電子天平：。 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA） 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB） Amies運(yùn)送培養(yǎng)基 輔酶NAD Maker 2000 DNA 聚合酶 瓊脂糖TAE加純凈水至 1000mL 16sRNA引物上游引物 5’GGCTTCGTCACCCTCTGT3’下游引物 5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’4 副豬嗜血桿菌分離與鑒定程序鼻腔拭子、肺臟、胸腔液、關(guān)節(jié)液拭子或肺臟在TSA上劃線挑取可疑菌落接種于TSB鏡檢/PCR鑒定/衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)副豬嗜血桿菌鏃鋝過潤啟婭澗駱讕瀘載撻贏禱驛懼。鼻腔拭子置于加有1%NAD的Amies運(yùn)送培養(yǎng)基中。 副豬嗜血桿菌的分離：用酒精燈火焰對肺臟表面進(jìn)行消毒，用消毒的剪刀和鑷子剪取一小塊病灶，用內(nèi)切面在加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的TAS平板邊緣1/4涂板，再用無菌的接種環(huán)采取三線式劃法，對細(xì)菌進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3648h；取鼻腔拭子于加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的TAS平板上三段劃線，37℃培養(yǎng)3648h。、%胎牛血清和10μg/mL NAD的無菌TSB肉湯，37℃培養(yǎng)1824h。，37℃培養(yǎng)36h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。副豬嗜血桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，菌體大小不一。 衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)用接種環(huán)分別挑取上述可疑菌的單菌落，水平劃線于綿羊鮮血瓊脂平板上， 再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，３７℃ 培養(yǎng) ２４ ｈ～４８ ｈ，觀察是否有“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象。在純化培養(yǎng)后的TSA 培養(yǎng)基上挑取單菌落，接入加有1% NAD 與5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)18h左右。陰性對照不加模板。由金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成，見表51。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。表1 副豬嗜血桿菌PCR鑒定引物序列引物PCR引物序列目標(biāo)條帶上游引物5’GGCTTCGTCACCCTCTGT3’822 bp下游引物5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’表2 PCR體系各組分一覽表組成成分用量(μL)2EasyTaq Super Mix10上游引物1下游引物1菌液1滅菌雙蒸水7 1%瓊脂糖凝膠電泳稱取1g瓊脂糖，加入100mL 1TAE 緩沖液中，加入核酸染料，依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子，瓊脂糖溶化后混勻倒入在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。鰻順褸悅漚縫囅屜鴨騫鬩藶騍擯駟謔。LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和3181。電泳條件：電壓110V，電泳時(shí)間30min。結(jié)果判定：電泳結(jié)束后，取出膠塊置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。隸誆熒鑒獫綱鴣攣駘賽澇鈧籜軍驢該。再分裝值滅菌的凍干管，每管1mL。最后將菌液置于凍干機(jī)凍干1~2天，凍干后置于80℃冰箱長期保存。八、動(dòng)物源偽結(jié)核棒狀桿菌的分離與鑒定方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物源偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定方法。 1 ℃ 顯微鏡：10 ~ 100 EP管: ml 采樣管 采樣棉拭子 微量加樣器 吸頭 （與微量加樣器相匹配） PCR儀 微波爐 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）3 培養(yǎng)基和試劑 DNA Marker 引物及擴(kuò)增片段長度PLD基因引物：上游：CTCAAGGCGTGGATGA下游：GGTAGCCAGATGGTGAGTAG 運(yùn)送培養(yǎng)基 10 ％的綿羊脫纖血平板 2Taq PCR MasterMix （含染料） 瓊脂糖 50TAE緩沖液：將242 g Tris 堿， ml 冰乙酸，100 ml EDTA（pH ），加純水至1000 ml。1TAE緩沖液：臨用時(shí)將50TAE緩沖液1份加蒸餾水49份，混勻即可。愜執(zhí)緝蘿紳頎陽灣熗鍵艤訥贓棧馴嘆。圖8 偽結(jié)核板狀桿菌分離鑒定程序5 操作步驟 采樣無菌采取膿汁樣品置于運(yùn)送培養(yǎng)基中，0 ℃—4 ℃保存。 培養(yǎng)將上述接種后的平板置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h~48h。（革蘭氏染色呈陽性小球桿菌）嚌鯖級廚脹鑲銦礦毀蘄鷯鑭嶁盧馭勞。 PCR鑒定 PCR模板的制備 ml生理鹽水的小型離心管中，12000r/min離心兩分鐘，棄上清。薊鑌豎牘熒浹醬籬鈴騫違紗駑緩馬蝕。擴(kuò)增目的片段長度約758 bp. PCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性2min，94 ℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10min，同時(shí)設(shè)立陰性和陽性對照。 電泳，加入100ml 1TAE緩沖液。依據(jù)樣品數(shù)選擇適宜的梳子。之后于紫外凝膠成像系統(tǒng)或紫外投射儀中觀察結(jié)果。 結(jié)果判定如果某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶與偽結(jié)核棒狀桿菌陽性對照的條帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，則該樣品可判定為偽結(jié)核棒狀桿菌。飪籮獰屬諾釙誣苧徑凜騙橥峽軋饈俠。烴斃潛籬賢擔(dān)視蠶賁粵貫飭驢噦餾艱。2℃ 生物安全柜 濁度計(jì)或者標(biāo)準(zhǔn)比濁管 微量加樣器1uL~1000uL 吸頭（與微量加樣器匹配）操作步驟 取出試劑盒，打開包裝待用。然后，（1~2108CFU/mL）。鋝豈濤軌躍輪蒔講嫗鍵礪脈賁膚饃麗。L空白對照孔中加入100181。蓋好板蓋并記錄菌號。2℃很穩(wěn)培養(yǎng)箱中孵育16~18小時(shí)。先觀察陰性對照孔和陽性對照孔：陰性對照孔應(yīng)無細(xì)菌生長，孔內(nèi)液體未見渾濁；陽性對照孔內(nèi)應(yīng)有細(xì)菌生長所形成的圓形或者網(wǎng)狀沉淀。如果陰性和陽性對照結(jié)果正常，繼續(xù)觀察其余孔內(nèi)細(xì)菌生長情況，在無細(xì)菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果記錄將MIC結(jié)果記錄在耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表（附件6）中。菌株編號氨芐西林阿莫西林/克拉維酸頭孢他啶頭孢噻呋慶大霉素大觀霉素四環(huán)素氟苯尼考磺胺異噁唑復(fù)方新諾明恩諾沙星氧氟沙星美羅培南乙酰甲喹安普霉素黏菌素AMA/CCTDCFTGMSPTTEFFCSFSXTENROFXIPMMEQAPCOL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。三、彎曲桿菌MIC養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號慶大霉素四環(huán)素萘啶酸環(huán)丙沙星氟苯尼考紅霉素克林霉素阿奇霉素泰利霉素GENTETNALCIPFFCERYCLIAZITEL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。