【正文】 市高新區(qū)虹陽街12號生豬83蘆山錢記鮮蛋養(yǎng)殖有限公司蘆山縣龍門鄉(xiāng)紅星村山口頭組蛋雞84四川簡陽大哥牧業(yè)有限公司成都市高新區(qū)壇罐鄉(xiāng)南埝村二社肉羊85大英縣潤豐禽業(yè)專業(yè)合作社大英縣隆盛鎮(zhèn)長灘寺村蛋雞86貴州?。?）播州區(qū)三合鎮(zhèn)永杰綠色養(yǎng)殖場貴州省遵義市播州區(qū)三合鎮(zhèn)冷水村前豐組肉雞87清鎮(zhèn)溫氏畜牧有限公司清鎮(zhèn)市紅楓湖鎮(zhèn)陳亮村肉雞88云南?。?）晉寧祥和農(nóng)牧有限公司昆明市晉寧區(qū)雙河彝族鄉(xiāng)荒川村委會撇坡村蛋雞89昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司昆明市東郊白沙河青龍村肉雞90陜西省（3）寶雞布爾肉羊開發(fā)有限公司陜西省寶雞市麟游縣九成宮鎮(zhèn)南坊肉羊91陜西大匠農(nóng)科產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司陜西省銅川市印臺區(qū)周陵農(nóng)業(yè)科技示范區(qū)蛋雞92陜西中墾華山牧業(yè)有限公司陜西省渭南市大荔縣韋林鎮(zhèn)果園奶牛93甘肅?。?）天水嘉信畜牧有限公司甘肅省天水市麥積區(qū)中灘鎮(zhèn)高新科技園奶牛94臨夏州眾博牧業(yè)有限責(zé)任公司甘肅省臨夏縣北塬鄉(xiāng)前石村蛋雞95青海?。?）青海天露乳業(yè)有限責(zé)任公司海東市樂都區(qū)雨潤鎮(zhèn)荒灘村奶牛96海晏牧源牛羊繁育專業(yè)合作社海北州海晏縣甘子河 達(dá)玉農(nóng)事隊(duì)肉羊97寧夏回族自治區(qū)（2）富源牧業(yè)（吳忠）有限責(zé)任公司吳忠市利通區(qū)扁擔(dān)溝鎮(zhèn)五里坡奶牛養(yǎng)殖基地奶牛98寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司吳忠市青銅峽市邵剛鎮(zhèn)苦城子村蛋雞99新疆維吾爾自治區(qū)（1）新疆天康畜牧科技有限公司瑪納斯商品豬育肥基地新疆石河子市152團(tuán)7連生豬100新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)（1）新疆棗園萬康農(nóng)牧科技有限公司新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)五家渠105團(tuán)2連、6連蛋雞（二）采樣類型病死動物采集臨床病料分離動物病原菌；健康動物采集泄殖腔或盲腸拭子分離大腸桿菌、腸球菌、沙門氏菌和彎曲桿菌；采集新鮮牛奶分離金黃色葡萄球菌。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌可根據(jù)各地分離情況進(jìn)行監(jiān)測。細(xì)菌分離與鑒定采用選擇性培養(yǎng)基，定向做大腸桿菌、腸球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和彎曲桿菌分離，用生化試驗(yàn)、PCR技術(shù)或血清學(xué)方法對分離物進(jìn)行鑒定。藥物敏感性測定用經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所質(zhì)量認(rèn)定的藥敏試驗(yàn)板進(jìn)行藥物敏感性檢測。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所匯總后，在12月31日前報(bào)送農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局。如EBL07010001，其中：E（大腸桿菌）B（牛）L（魯）07（年）01（月）0001（菌株編號）。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下。 電子天平：。 采樣管或商品化采樣棉拭子。 麥康凱瓊脂。1℃，培養(yǎng)18~24h；挑取大腸桿菌可疑菌落純化生化鑒定大腸桿菌識饒鎂錕縊灩筧嚌儼淒儂減攙蘇鯊運(yùn)。1℃培養(yǎng)16～18h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。本方法適用于各種動物中沙門氏菌的分離與鑒定。1℃和42℃177。 生物安全柜。 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）。 微量加樣器：1μL～1000μL。3 培養(yǎng)基和試劑 標(biāo)準(zhǔn)菌株：沙門氏菌CVCC 541 DNA Maker Taq DNA 聚合酶 dNTP 瓊脂糖 5TBE緩沖液三羥甲基氨基甲烷（Tris） 硼酸 EDTA（） 20mL加純凈水至 1000mLTAE 沙門氏菌顯色瓊脂。 核酸染料。1℃，培養(yǎng)18~24h；或TTB增菌液，42177。 沙門氏菌的分離 將拭子置于SC增菌液，36℃177。 將菌液混勻，接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，36℃177。閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖輛塤鵜蘞鰱幟。 PCR法鑒定 PCR模板的制備用接種環(huán)從營養(yǎng)瓊脂上挑選16～24h的純培養(yǎng)物，12000r/min離心2min，棄上清。 PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s, 64℃退火30s，72℃延伸30s, 30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，同時設(shè)立陰性和陽性對照。諺辭調(diào)擔(dān)鈧諂動禪瀉類謹(jǐn)覡鸞幀鮮奧。 電泳條件電壓110V，電泳時間30min。三、動物源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用于耐藥性測定的動物源金黃色葡萄球菌的分離和鑒定方法。1℃和42℃。、發(fā)病動物組織和上呼吸道拭子：無菌操作取發(fā)病動物組織和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入滅菌試管中，0℃～4℃保存不超過48h?！?77。 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到顯色培養(yǎng)基平板上，無菌操作將發(fā)病動物組織直接劃線，36℃177。用營養(yǎng)瓊脂純化一代，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。 挑取顯色平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂平板，36℃177。 新鮮兔血漿制備：，加蒸餾水100mL,溶解后過濾，裝瓶，121℃高壓滅菌15min。1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。四、動物源彎曲桿菌的分離與鑒定方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的分離鑒定方法。1℃，36℃177。：5%氧氣+10%二氧化碳+85%氮?dú)?，或商品化微需氧包? 微量加樣器：1μL～1000μL。倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驁絛鯛鱧俁魷親。 上樣緩沖液 溴化乙錠溶液（10mg/mL）：稱取1g溴化乙錠溶于100mL水中，用磁力攪拌器攪拌數(shù)小時直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。1℃，微需氧條件下培養(yǎng)24~48h挑取彎曲桿菌可疑菌落純化生化鑒定PCR鑒定空腸彎曲桿菌或結(jié)腸彎曲桿菌瑣釙濺曖惲錕縞馭篩涼貿(mào)錒戧晉魘繅。1℃恒溫培養(yǎng)箱中，在微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h。對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進(jìn)行生化鑒定，并進(jìn)行結(jié)果判定。懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷卻5min后，12000r/min(4℃)離心2min，取上清作為PCR模板。 PCR反應(yīng)條件采用的PCR反應(yīng)條件見下表。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，TBE緩沖液（或1TAE緩沖液）淹沒膠面。L上樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。 結(jié)果判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。本方法適用于各種動物中屎腸球菌和糞腸球菌的分離與鑒定。1℃。 生化鑒定卡或商品化試條。3 培養(yǎng)基和試劑 運(yùn)送培養(yǎng)基。1℃，培養(yǎng)18~24h；挑取腸球菌可疑菌落純化生化鑒定屎腸球菌或糞腸球菌鰓躋峽禱紉誦幫廢掃減萵輳慘纈騾窺。1℃培養(yǎng)16～18h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。 本方法適用于畜禽源魏氏梭菌的分離與鑒定。 1TAE緩沖液臨時用是將50TAE緩沖液1份加蒸餾水49份，混勻即可。：做好采樣準(zhǔn)備后赴養(yǎng)殖場或屠宰廠，針對擬采樣的健康畜/禽或發(fā)病畜/禽，用無菌棉簽蘸取其排泄的新鮮糞便（用滅菌鑷子扒開糞便表皮，蘸取內(nèi)部糞便），置于運(yùn)送培養(yǎng)基。，做好標(biāo)注后立即置于帶有冰袋的保溫設(shè)備中，轉(zhuǎn)運(yùn)至試驗(yàn)室（轉(zhuǎn)運(yùn)時間不超過48h）?，撝C齷蘄賞組靄縐嚴(yán)減籩諏戀鄰驂灝。挑取黑色且有乳白色暈圈的單菌落接種于綿羊血瓊脂平板上，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，挑取有溶血環(huán)的菌落。 納疇鰻吶鄖禎銣膩鰲錟顫階躦萵騍潤。已純化的菌株可用于后續(xù)的生化鑒定或PCR鑒定試驗(yàn)。5 h 內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。在透射光下檢查細(xì)菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動力。魏氏梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。將試管于5 ℃左右放置1 h，檢查明膠液化情況。（PCR）鑒定（1）PCR模板制備 ，按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作指南提取菌株基因組DNA，作為PCR模板。（3）PCR反應(yīng)條件 94℃預(yù)變性 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃1min30s，共30個循環(huán)；72℃ 7min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。 菌種保存將鑒定完畢并確認(rèn)是魏氏梭菌的菌株接種于綿羊血瓊脂平板上，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，將板子上的菌落全部刮下，置于含有500μL ，和500μL甘油（60%）充分混勻，放入80℃超低溫冰箱保存。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下。 電子天平：。加純凈水至 1000mL 16sRNA引物上游引物 5’GGCTTCGTCACCCTCTGT3’下游引物 5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’4 副豬嗜血桿菌分離與鑒定程序鼻腔拭子、肺臟、胸腔液、關(guān)節(jié)液拭子或肺臟在TSA上劃線挑取可疑菌落接種于TSB鏡檢/PCR鑒定/衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)副豬嗜血桿菌鏃鋝過潤啟婭澗駱讕瀘載撻贏禱驛懼。 副豬嗜血桿菌的分離：用酒精燈火焰對肺臟表面進(jìn)行消毒，用消毒的剪刀和鑷子剪取一小塊病灶，用內(nèi)切面在加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的TAS平板邊緣1/4涂板，再用無菌的接種環(huán)采取三線式劃法，對細(xì)菌進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3648h；取鼻腔拭子于加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的TAS平板上三段劃線，37℃培養(yǎng)3648h。，37℃培養(yǎng)36h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。 衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)用接種環(huán)分別挑取上述可疑菌的單菌落，水平劃線于綿羊鮮血瓊脂平板上， 再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，３７℃ 培養(yǎng) ２４ ｈ～４８ ｈ，觀察是否有“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象。陰性對照不加模板。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸1 min，30 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。鰻順褸悅漚縫囅屜鴨騫鬩藶騍擯駟謔。電泳條件：電壓110V，電泳時間30min。隸誆熒鑒獫綱鴣攣駘賽澇鈧籜軍驢該。最后將菌液置于凍干機(jī)凍干1~2天，凍干后置于80℃冰箱長期保存。 1 ℃ 顯微鏡：10 ~ 100 EP管: ml 采樣管 采樣棉拭子 微量加樣器 吸頭 （與微量加樣器相匹配） PCR儀 微波爐 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）3 培養(yǎng)基和試劑 DNA Marker 引物及擴(kuò)增片段長度PLD基因引物：上游：CTCAAGGCGTGGATGA下游：GGTAGCCAGATGGTGAGTAG 運(yùn)送培養(yǎng)基 10 ％的綿羊脫纖血平板 2Taq PCR MasterMix （含染料） 瓊脂糖 50TAE緩沖液：將242 g Tris 堿， ml 冰乙酸，100 ml EDTA（pH ），加純水至1000 ml。愜執(zhí)緝蘿紳頎陽灣熗鍵艤訥贓棧馴嘆。 培養(yǎng)將上述接種后的平板置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h~48h。 PCR鑒定 PCR模板的制備 ml生理鹽水的小型離心管中，12000r/min離心兩分鐘，棄上清。擴(kuò)增目的片段長度約758 bp. PCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性2min，94 ℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30個循環(huán)，最后72℃終延伸10min，同時設(shè)立陰性和陽性對照。依據(jù)樣品數(shù)選擇適宜的梳子。 結(jié)果判定如果某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶與偽結(jié)核棒狀桿菌陽性對照的條帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，則該樣品可判定為偽結(jié)核棒狀桿菌。烴斃潛籬賢擔(dān)視蠶賁粵貫飭驢噦餾艱。然后，（1~2108CFU/mL）。L空白對照孔中加入100181。2℃很穩(wěn)培養(yǎng)箱中孵育16~18小時。如果陰性和陽性對照結(jié)果正常，繼續(xù)觀察其余孔內(nèi)細(xì)菌生長情況，在無細(xì)菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。菌株編號氨芐西林阿莫西林/克拉維酸頭孢他啶頭孢噻呋慶大霉素大觀霉素四環(huán)素氟苯尼考磺胺異噁唑復(fù)方新諾明恩諾沙星氧氟沙星美羅培南乙酰甲喹安普霉素黏菌素AMA/CCTDCFTGMSPTTEFFCSFSXTENROFXIPMMEQAPCOL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。