【正文】 堂馬村生豬71清遠(yuǎn)市廣生元畜牧發(fā)展有限公司清遠(yuǎn)市佛岡縣湯塘鎮(zhèn)高嶺村蛋雞72華農(nóng)溫氏佛岡分公司龍南豬場清遠(yuǎn)市佛岡縣石角鎮(zhèn)龍南石聯(lián)村生豬73廣西壯族自治區(qū)（3）廣西農(nóng)墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場廣西橫縣良圻農(nóng)場獸醫(yī)技術(shù)中心生豬74廣西富鳳農(nóng)牧有限公司南寧市邕武路北肉雞75廣西華興食品有限公司廣西南寧市興寧區(qū)五塘鎮(zhèn)四平村平天坡肉鴨76海南省（1）海南（潭牛）文昌雞股份有限公司海南省海口市美蘭區(qū)大致坡鎮(zhèn)排山村肉雞77重慶市（4）重慶日泉農(nóng)牧有限公司重慶市榮昌區(qū)雙河街道高豐村一組生豬78重慶浩豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司重慶市江津區(qū)李市鎮(zhèn)三角壩居圓社蛋雞79重慶市六九畜牧科技股份有限公司重慶市黔江區(qū)城西七路計生委大院69辦事處生豬80墊江縣龍盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司重慶市墊灑縣高安鎮(zhèn)龍門寨生豬81四川?。?）四川省鑫又新禽業(yè)有限公司成都市金堂縣又新鎮(zhèn)三元村11組蛋雞82四川省羌山農(nóng)牧科技股份有限公司四川省綿陽市高新區(qū)虹陽街12號生豬83蘆山錢記鮮蛋養(yǎng)殖有限公司蘆山縣龍門鄉(xiāng)紅星村山口頭組蛋雞84四川簡陽大哥牧業(yè)有限公司成都市高新區(qū)壇罐鄉(xiāng)南埝村二社肉羊85大英縣潤豐禽業(yè)專業(yè)合作社大英縣隆盛鎮(zhèn)長灘寺村蛋雞86貴州省（2）播州區(qū)三合鎮(zhèn)永杰綠色養(yǎng)殖場貴州省遵義市播州區(qū)三合鎮(zhèn)冷水村前豐組肉雞87清鎮(zhèn)溫氏畜牧有限公司清鎮(zhèn)市紅楓湖鎮(zhèn)陳亮村肉雞88云南?。?）晉寧祥和農(nóng)牧有限公司昆明市晉寧區(qū)雙河彝族鄉(xiāng)荒川村委會撇坡村蛋雞89昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司昆明市東郊白沙河青龍村肉雞90陜西省（3）寶雞布爾肉羊開發(fā)有限公司陜西省寶雞市麟游縣九成宮鎮(zhèn)南坊肉羊91陜西大匠農(nóng)科產(chǎn)業(yè)（集團）有限公司陜西省銅川市印臺區(qū)周陵農(nóng)業(yè)科技示范區(qū)蛋雞92陜西中墾華山牧業(yè)有限公司陜西省渭南市大荔縣韋林鎮(zhèn)果園奶牛93甘肅?。?）天水嘉信畜牧有限公司甘肅省天水市麥積區(qū)中灘鎮(zhèn)高新科技園奶牛94臨夏州眾博牧業(yè)有限責(zé)任公司甘肅省臨夏縣北塬鄉(xiāng)前石村蛋雞95青海省（2）青海天露乳業(yè)有限責(zé)任公司海東市樂都區(qū)雨潤鎮(zhèn)荒灘村奶牛96海晏牧源牛羊繁育專業(yè)合作社海北州海晏縣甘子河 達玉農(nóng)事隊肉羊97寧夏回族自治區(qū)（2）富源牧業(yè)（吳忠）有限責(zé)任公司吳忠市利通區(qū)扁擔(dān)溝鎮(zhèn)五里坡奶牛養(yǎng)殖基地奶牛98寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司吳忠市青銅峽市邵剛鎮(zhèn)苦城子村蛋雞99新疆維吾爾自治區(qū)（1）新疆天康畜牧科技有限公司瑪納斯商品豬育肥基地新疆石河子市152團7連生豬100新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團（1）新疆棗園萬康農(nóng)牧科技有限公司新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團五家渠105團2連、6連蛋雞（二）采樣類型病死動物采集臨床病料分離動物病原菌；健康動物采集泄殖腔或盲腸拭子分離大腸桿菌、腸球菌、沙門氏菌和彎曲桿菌；采集新鮮牛奶分離金黃色葡萄球菌。采樣時，大型、中小型養(yǎng)殖場各半；主要采出欄前動物、鮮牛奶；分離大腸桿菌和腸球菌，每個養(yǎng)殖場采樣30~50份，分離其他細(xì)菌，根據(jù)分離率確定樣品數(shù)量。動物腸道或拭子、體表淋巴結(jié)大腸桿菌100株，偽結(jié)核棒狀桿菌100株，魏氏梭菌100株北京養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，屠宰廠為雞、豬源樣品。泄殖腔拭子或動物盲腸，牛奶大腸桿菌200株，腸球菌200株，沙門氏菌、金葡菌和彎曲桿菌合計100株陜西養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，奶牛場3個，屠宰廠為雞、豬源樣品。聯(lián) 系 人：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局 馮梁中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 宋立聯(lián)系電話：01059191430 01062103679附件：技術(shù)要點（MIC測定）使用方法34 / 34附件22019年動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)量樣品來源養(yǎng)殖場要求采樣部位細(xì)菌種類與數(shù)量要求遼寧、海南、甘肅養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，奶牛場3個，屠宰廠為雞、豬源樣品。2019年繼續(xù)監(jiān)測腸球菌和魏氏梭菌對促生長用抗菌藥物的耐藥性。（二）樣品應(yīng)從養(yǎng)殖場（包括養(yǎng)雞場、養(yǎng)鴨場、養(yǎng)豬場、養(yǎng)羊場、奶牛場）或屠宰場抽取。（二）監(jiān)測腸球菌、金黃色葡萄球菌、魏氏梭菌和偽結(jié)核棒狀桿菌等4種細(xì)菌對青霉素、阿莫西林/克拉維酸、紅霉素、克林霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢西丁、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、萬古霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、苯唑西林、慶大霉素、泰妙菌素、替米考星、利柰唑胺等18種抗菌藥的耐藥性。監(jiān)測省份和監(jiān)測數(shù)量見附件2。聞創(chuàng)溝燴鐺險愛氌譴凈禍測樅鋸鰻鯪。矚慫潤厲釤瘞睞櫪廡賴賃軔朧礙鱔絹。有條件的省份應(yīng)積極爭取財政支持，制定并組織實施本轄區(qū)動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計劃。廈礴懇蹣駢時盡繼價騷巹癩龔長鰥檷。預(yù)頌圣鉉儐歲齦訝驊糴買闥齙絀鰒現(xiàn)。擁締鳳襪備訊顎輪爛薔報贏無貽鰓閎。（二）按照任務(wù)分工，各監(jiān)測任務(wù)承擔(dān)單位的電子版總結(jié)在11月25日前報中監(jiān)所。泄殖腔拭子或動物盲腸，牛奶大腸桿菌200株，腸球菌200株，沙門氏菌、金葡菌、彎曲桿菌各50株天津、青海養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，奶牛場3個，屠宰廠為雞、豬源樣品。動物腸道或拭子魏氏梭菌200株湖北和鄰近3個省份，其他省份養(yǎng)殖場或屠宰廠20個，屠宰廠為肉雞和豬源樣品。泄殖腔拭子或動物盲腸大腸桿菌200株，腸球菌200株重慶養(yǎng)殖場或屠宰廠20個屠宰廠為雞、豬源樣品。附件12019年度動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測采樣和檢測技術(shù)要點采樣安排（一）采樣地點各監(jiān)測任務(wù)承擔(dān)單位按照本監(jiān)測計劃進行選場、采樣和分離細(xì)菌。貓蠆驢繪燈鮒誅髏貺廡獻鵬縮職鯡樣。檢測用質(zhì)控菌株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所統(tǒng)一供應(yīng)。菌種簡寫建議為：E（大腸桿菌）、S（沙門氏菌）、SA（金黃色葡萄球菌）、ECi（腸球菌）、CJ（空腸彎曲桿菌）、CC（結(jié)腸彎曲桿菌）動物簡寫建議為：B（牛）、P（豬）、C（雞）、D（鴨）注：a為喂奶豬或保溫雞，b為保育豬或生長雞，c為育成豬或雞，d為種母豬或產(chǎn)蛋雞。 顯微鏡：10～100。 大腸桿菌陽性血清。 大腸桿菌的鑒定對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒定。1℃。 冷凍離心機。buffer三羥甲基氨基甲烷（Tris）242g 氯化鈉。1℃培養(yǎng)18～24h 或TTB增菌液，42℃177。 沙門氏菌的鑒定 對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒定，（PCR）鑒定。 慫闡譜鯪逕導(dǎo)嘯畫長涼馴鴇撟鉍鲞謠。 結(jié)果判定電泳結(jié)束后，取出膠塊置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進行成像分析。 顯微鏡：10～100。鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞闋簣擇睜鮪謅。1℃培養(yǎng)24～48h。1℃培養(yǎng)18～24h。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。1℃，42℃177。 吸頭（與微量加樣器相匹配） 微波爐 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）培養(yǎng)基和試劑 質(zhì)控菌株：空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 33560） DNA Marker 引物及擴增片段長度 引物空腸彎曲菌：上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’，下游 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’，擴增片段長度為 773bp。驍顧燁鶚巰瀆蕪領(lǐng)鱺賻驃弒綈閶魎齠。觀察24h培養(yǎng)與48h培養(yǎng)的瓊脂平板上的菌落形態(tài)。峴揚斕滾澗輻灄興渙藺詐機憒頇驤經(jīng)。詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁靈韜鰍櫝驥鱭。如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與空腸彎曲菌陽性對照的條帶在一條直線上，即它們與加樣孔的距離相同，則該樣品分離到的菌株可判定為空腸彎曲桿菌；如果與結(jié)腸彎曲菌陽性對照的條帶在一條直線上，即它們與加樣孔的距離相同，則該樣品分離到的菌株可判定為結(jié)腸彎曲桿菌；脹鏝彈奧秘孫戶孿釔賻鏘詠繞敘驄驗。 電子天平：。 腸球菌顯色培養(yǎng)基。 屎腸球菌和糞腸球菌的鑒定對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒定、判定結(jié)果。 核酸染料 16S rDNA通用引物（預(yù)期擴增子大小為1500bp）上游為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA下游為1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT4 魏氏梭菌的分離與鑒定程序運送培養(yǎng)基接種于FTG增菌液，37℃，厭氧培養(yǎng)2024h1mlFTG增菌液+TSC瓊脂混合挑取黑色菌落，接種于綿羊血瓊脂平板畜/禽糞便拭子或腸道內(nèi)容物挑取具溶血環(huán)菌落PCR鑒定魏氏梭菌生化鑒定使用相同綿羊血瓊脂平板純化23次陽簍埡鮭罷規(guī)嗚舊巋錟麗鮑軫溈騫硨。謾飽兗爭詣繚鮐癩別瀘鯽礎(chǔ)輪駭騷獅。用相同綿羊血瓊脂平板純化23次。 風(fēng)攆鮪貓鐵頻鈣薊糾廟誑繃紙鯉騏鍔。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長，無動力的菌株只沿穿刺線生長。如果培養(yǎng)基是固態(tài)，再放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，重復(fù)檢查明膠是否液化。擴增產(chǎn)物長度約為1500bp。騅憑鈳銘僥張礫陣軫藹攬齊彎議罵擰。 分析天平： 恒溫水浴鍋：37℃～100℃ 生物安全柜 顯微鏡：10～100 PCR儀 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀） 微量加樣器：1μL～1000μL 吸頭（與微量加樣器匹配）3 培養(yǎng)基和試劑標(biāo)準(zhǔn)菌株：副豬嗜血桿菌SH0165質(zhì)控菌株：胸膜肺炎放線桿菌ATCC 27090 無支原體胎牛血清。邁蔦賺陘賓唄擷鷦訟湊幟結(jié)廢擴駑彎。劇妝諢貰攖蘋塒呂侖廟痙湯籪糶駒責(zé)。臠龍訛驄椏業(yè)變墊羅蘄囂馱廣閏駙孫。穡釓虛綹滟鰻絲懷紓濼視嬌賭謗駔墮。浹繢膩叢著駕驃構(gòu)碭湊農(nóng)瑤帳結(jié)駁噴。4 偽結(jié)核棒狀桿菌分離與鑒定程序動物膿汁樣品運送培養(yǎng)基接種于10 ％的綿羊脫纖血平板挑取偽結(jié)核棒狀桿菌可疑菌落純化生化鑒定PCR鑒定偽結(jié)核棒狀桿菌貞廈給鏌綞牽鎮(zhèn)獵鎦龐朮戧籩賂馱見。100℃水浴10min，12000r/min離心兩分鐘，取上清作為PCR模板。凝膠凝固后，放入電泳槽，于加樣孔中加樣，以 DL2000為對照，120v，30min 后，在溴化乙錠溶液中浸泡20min。材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱35177。L無菌肉湯。蹤飯夢摻釣貞綾賁發(fā)蘄韃釓嶇淶饋麩。四、腸球菌和魏氏梭菌MIC（促生長抗菌藥物監(jiān)測）養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號阿維拉霉素維吉尼亞霉素四環(huán)素吉他霉素桿菌肽那西肽黃霉素恩拉霉素喹烯酮氟苯尼考沃尼妙林AVLVGATETFFNBCTNOSFLVERAQCTFFCVOL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。擷偽氫鱧轍冪聹諛詼龐復(fù)堝窮馭餿職。 菌液接種除空白對照外，其余的95孔加入制備好（用前要混勻）的菌液100181。附件5 藥敏試驗檢測試劑盒（MIC測定）使用方法范圍本方法規(guī)定了動物源細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、魏氏梭菌和偽結(jié)核棒狀桿菌）藥敏檢測試劑盒的操作方法。加熱熔化后倒入水平臺面的凝膠盤中，膠板厚約5 mm。 生化鑒定對于已純化的菌落，可使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進行生化鑒定，并對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進行結(jié)果判定。 溴化乙錠溶液（10㎎/ml）：稱取1 g溴化乙錠溶于100 ml水中，用磁力攪拌器攪拌數(shù)小時至完全溶解，避光冷藏（4 ℃）保存。再將分裝的菌進行逐級冷凍，先后置于4℃，20℃，80℃至少4h以上。L上樣緩沖液混勻后加入加樣孔，每次電泳時，各做一個陽性對照和陰性對照。采取20 μL反應(yīng)體系，組成成分見表52。該櫟諼碼戇沖巋鳧薩錠謨贛贅眾騶嶠。榿貳軻謄壟該檻鯔塏賽緯闥糝鍔駕躦。1℃。緦徑銚膾齲轎級鏜撟廟耬癬紇徑驕鄰。夾覡閭輇駁檔驀遷錟減汆藥徑鴕駭槍。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃，表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。（1）硝酸鹽還原—動力試驗