【正文】 四、腸球菌和魏氏梭菌MIC（促生長抗菌藥物監(jiān)測）養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號阿維拉霉素維吉尼亞霉素四環(huán)素吉他霉素桿菌肽那西肽黃霉素恩拉霉素喹烯酮氟苯尼考沃尼妙林AVLVGATETFFNBCTNOSFLVERAQCTFFCVOL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。二、G+菌（腸球菌、金黃色葡萄球菌和偽結核棒狀桿菌）MIC 養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號青霉素阿莫西林/克拉維酸頭孢噻呋頭孢西丁苯唑西林慶大霉素多西環(huán)素恩諾沙星氧氟沙星磺胺異噁唑復方新諾明氟苯尼考紅霉素克林霉素替米考星泰妙菌素利奈唑胺萬古霉素PA/CCFTCXOXAGENDOXENROFLSFSXTFFCERYCLITILTMLNZVA注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。附件6敏感性檢測結果統(tǒng)計表一、G菌（大腸桿菌、沙門氏菌和副豬嗜血桿菌）MIC 養(yǎng)殖場： 檢測員： 年 月 日婭鑠機職銦夾簣軒蝕騫設猶饌還館縉。蹤飯夢摻釣貞綾賁發(fā)蘄韃釓嶇淶饋麩。擷偽氫鱧轍冪聹諛詼龐復堝窮馭餿職。 觀察結果在襯有黑底板的光線下，用肉眼觀察。 孵育將檢測板置于35℃177。L無菌肉湯。 菌液接種除空白對照外，其余的95孔加入制備好（用前要混勻）的菌液100181。最后，用試劑盒中的肉湯按照使用說明書要求的倍數(shù)稀釋，混勻備用。 菌液制備將無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，直接取過夜培養(yǎng)皿上數(shù)個新鮮菌落，與適量無菌生理鹽水混勻。材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌設備外，其他設備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱35177。附件5 藥敏試驗檢測試劑盒（MIC測定）使用方法范圍本方法規(guī)定了動物源細菌（大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、魏氏梭菌和偽結核棒狀桿菌）藥敏檢測試劑盒的操作方法。必要時可通過16S rRNA測序進行進一步驗證。紳藪瘡顴訝標販繯轅賽憮賄豎毆饉蒞。凝膠凝固后，放入電泳槽，于加樣孔中加樣，以 DL2000為對照，120v，30min 后，在溴化乙錠溶液中浸泡20min。加熱熔化后倒入水平臺面的凝膠盤中，膠板厚約5 mm。齡踐硯語蝸鑄轉絹攤濼絡減貽顏饌農。 PCR反應體系根據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配置PCR反應體系。100℃水浴10min，12000r/min離心兩分鐘，取上清作為PCR模板。 生化鑒定對于已純化的菌落，可使用細菌微量生化反應管進行生化鑒定，并對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行結果判定。 純化觀察24h和48h的血瓊脂平板上的菌落形態(tài)，挑取圓形、不透明、干燥、松脆、瓷白色或淡黃色、。 分離將新鮮的或運送培養(yǎng)基中的膿汁拭子在10％綿羊脫纖血瓊脂平板上涂抹，用經(jīng)火焰滅菌后冷卻的接種環(huán)劃線。4 偽結核棒狀桿菌分離與鑒定程序動物膿汁樣品運送培養(yǎng)基接種于10 ％的綿羊脫纖血平板挑取偽結核棒狀桿菌可疑菌落純化生化鑒定PCR鑒定偽結核棒狀桿菌貞廈給鏌綞牽鎮(zhèn)獵鎦龐朮戧籩賂馱見。 溴化乙錠溶液（10㎎/ml）：稱取1 g溴化乙錠溶于100 ml水中，用磁力攪拌器攪拌數(shù)小時至完全溶解，避光冷藏（4 ℃）保存。鈀燭罰櫝箋礱颼畢韞糲銨鵬駱隸驅訛。本標準適用于膿汁中偽結核棒狀桿菌的分離鑒定2 設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下： 生物安全柜 冰箱：0 ℃ ~ 4 ℃ 和 20 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ 177。浹繢膩叢著駕驃構碭湊農瑤帳結駁噴。再將分裝的菌進行逐級冷凍，先后置于4℃，20℃，80℃至少4h以上。 副豬嗜血桿菌的保存在純化后的平板上挑取單菌落與8mL肉湯中，置于37℃搖床中培養(yǎng)18~24h，待菌液生長至對數(shù)期，于9000r/min，離心3分鐘，棄去上清液，加入4mL滅菌的脫脂牛奶，重懸。如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與副豬嗜血桿菌陽性對照的條帶在一條直線上，即條帶與加樣孔的距離相同，而陰性對照無此條帶，則該樣品分離到的菌株可初步判定為副豬嗜血桿菌。穡釓虛綹滟鰻絲懷紓濼視嬌賭謗駔墮。L上樣緩沖液混勻后加入加樣孔，每次電泳時，各做一個陽性對照和陰性對照。取10181。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。臠龍訛驄椏業(yè)變墊羅蘄囂馱廣閏駙孫。采取20 μL反應體系，組成成分見表52。根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA(M75065)序列設計引物。取培養(yǎng)后的菌液1μL做PCR鑒定，陽性對照為副豬嗜血桿菌參考株SH0165。劇妝諢貰攖蘋塒呂侖廟痙湯籪糶駒責。該櫟諼碼戇沖巋鳧薩錠謨贛贅眾騶嶠。 副豬嗜血桿菌的鑒定挑取純培養(yǎng)的圓形、光滑、無色透明可疑菌落涂片，革蘭染色后，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。嶁硤貪塒廩袞憫倉華糲饃勵騮詡駐賭。邁蔦賺陘賓唄擷鷦訟湊幟結廢擴駑彎。榿貳軻謄壟該檻鯔塏賽緯闥糝鍔駕躦。圖7 副豬嗜血桿菌分離鑒定程序 采樣 選擇養(yǎng)殖場或屠宰場，滅菌棉拭子采集動物鼻腔拭子，或屠宰豬的完整肺臟、心包液、胸腔積液、關節(jié)液和腦脊液，置入冰盒中，保存時間不超過48小時。 醋酸 。buffer三羥甲基氨基甲烷（Tris） 分析天平： 恒溫水浴鍋：37℃～100℃ 生物安全柜 顯微鏡：10～100 PCR儀 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀） 微量加樣器：1μL～1000μL 吸頭（與微量加樣器匹配）3 培養(yǎng)基和試劑標準菌株：副豬嗜血桿菌SH0165質控菌株：胸膜肺炎放線桿菌ATCC 27090 無支原體胎牛血清。1℃。 冰箱：24℃和20℃。本方法適用于副豬嗜血桿菌的分離與鑒定。騅憑鈳銘僥張礫陣軫藹攬齊彎議罵擰。緦徑銚膾齲轎級鏜撟廟耬癬紇徑驕鄰。偽澀錕攢鴛擋緬鐒鈞錠鈴鉍蹌鏟驊擷。（4）電泳 反應結束后，%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為：電壓120V，電泳時間25min。擴增產(chǎn)物長度約為1500bp。夾覡閭輇駁檔驀遷錟減汆藥徑鴕駭槍。趕輾雛紈顆鋝討躍滿賺蜆騍純蠅驪銬。攙閿頻嶸陣澇諗譴隴瀘鐙澮蹤島騁檻。如果培養(yǎng)基是固態(tài)，再放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，重復檢查明膠是否液化。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃，表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。 鐒鸝餉飾鐔閌貲諢癱騮吶轉鮭錢驗鎖。15 min 內出現(xiàn)紅色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許鋅粉，放置10 min，出現(xiàn)紅色者，表明該菌株不能還原硝酸鹽。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長，無動力的菌株只沿穿刺線生長。（1）硝酸鹽還原—動力試驗 用接種環(huán)（針）取FTG 培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力硝酸鹽培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h。魏氏梭菌發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，但培養(yǎng)基不變黑。 ℃水浴中培養(yǎng)2 h 后，每小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，該現(xiàn)象的特點是乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質，通常會上升到培養(yǎng)基表面。 風攆鮪貓鐵頻鈣薊糾廟誑繃紙鯉騏鍔。如果形態(tài)多樣，表明培養(yǎng)液不純，應劃線接種綿羊血瓊脂平板，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，挑取單個典型有溶血環(huán)的菌落接種到FTG 培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h，做進一步純化。挑取菌落進行革蘭氏染色，鏡檢觀察細菌形態(tài)。 魏氏梭菌鑒定從綿羊血瓊脂平板上任選5 個（小于5 個全選）有溶血環(huán)的菌落，分別接種到FTG 培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h。用相同綿羊血瓊脂平板純化23次。待瓊脂再次凝固后，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h。吸取增菌液1mL放入90mm無菌平皿內，每個平皿傾注冷卻至50 ℃的TSC 15 mL，混勻。（2）腸道內容物：無菌剪開腸段，用接種環(huán)刮取內容物， 放入含2mL FTG的5mL離心管中混勻，用石蠟封住液面，放入?yún)捬豕ぷ髡净蛎芊馀囵B(yǎng)罐中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2024 h進行增菌。謾飽兗爭詣繚鮐癩別瀘鯽礎輪駭騷獅。懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮揚銥鯊臘騖韋。鋇嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團藺締崳惲囂驁瘋。溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應釵藹紼較騮額。 核酸染料 16S rDNA通用引物（預期擴增子大小為1500bp）上游為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA下游為1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT4 魏氏梭菌的分離與鑒定程序運送培養(yǎng)基接種于FTG增菌液，37℃，厭氧培養(yǎng)2024h1mlFTG增菌液+TSC瓊脂混合挑取黑色菌落，接種于綿羊血瓊脂平板畜/禽糞便拭子或腸道內容物挑取具溶血環(huán)菌落PCR鑒定魏氏梭菌生化鑒定使用相同綿羊血瓊脂平板純化23次陽簍埡鮭罷規(guī)嗚舊巋錟麗鮑軫溈騫硨。 商品化細菌DNA提取試劑盒 質控菌株：糞腸球菌 ATCC29212，金黃色葡萄球菌 ATCC29213 DNA Marker（2000bp） Taq DNA 聚合酶 dNTPs 瓊脂糖 50TAE緩沖液242g三羥甲基氨基甲烷（Tris）堿， EDTA()，加純水至1000mL稟虛嬪賑維嚌妝擴踴糶欏灣鯧飫驃餒。 2 設備和材料 需要的主要設備和材料如下： 商品化采樣管或采樣棉簽； 普通冰箱：2 ℃～4℃和20℃； 超低溫冰箱：80℃； 恒溫培養(yǎng)箱：37℃； 恒溫水浴鍋：37℃～100℃； 生物安全柜； 天平： g； 顯微鏡：10～100； 微量加樣器及吸頭：1μL1000μL；； 離心管：2mL，5mL； 試管：18mm180mm； 培養(yǎng)皿：直徑60 mm，直徑90 mm； 厭氧氣罐：用于厭氧工作站，氣體成分：88%N2，7%H2，5%CO2； 密封培養(yǎng)罐；：用于密封罐，可吸收罐中的全部O2，同時產(chǎn)生約21%的CO2； 厭氧工作站； PCR儀； 微波爐； 電泳儀； 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)。六、動物源魏氏梭菌分離與鑒定方法1 范圍 本方法規(guī)定了畜禽源魏氏梭菌（Clostridium perfringens）的分離與鑒定。 屎腸球菌和糞腸球菌的鑒定對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒定、判定結果。1℃培養(yǎng)18～24h； 挑取紅色至紫紅色的可疑菌落，顯色瓊脂上純化一代，36℃177。圖5 屎腸球菌和糞腸球菌分離與鑒定程序 采樣 選擇養(yǎng)殖場或屠宰場，滅菌棉拭子采集動物肛門或泄殖腔樣品，置入運送培養(yǎng)基中，保存時間不超過48小時。動物肛門或泄殖腔拭子運送培養(yǎng)基接種于腸球菌顯色瓊脂，36177。 腸球菌顯色培養(yǎng)基。 吸頭（與微量加樣器匹配）。 采樣管或商品化采樣棉拭子。 生物安全柜。 電子天平：。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。2 設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其它設備和材料如下。五、動物源屎腸球菌和糞腸球菌的分離與鑒定方法1 范圍本方法規(guī)定了用于屎腸球菌和糞腸球菌分離與鑒定的方法。如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與空腸彎曲菌陽性對照的條帶在一條直線上，即它們與加樣孔的距離相同