【正文】 賓唄擷鷦訟湊幟結(jié)廢擴駑彎。、%胎牛血清和10μg/mL NAD的無菌TSB肉湯，37℃培養(yǎng)1824h。嶁硤貪塒廩袞憫倉華糲饃勵騮詡駐賭。，37℃培養(yǎng)36h，待進一步細菌鑒定。 副豬嗜血桿菌的鑒定挑取純培養(yǎng)的圓形、光滑、無色透明可疑菌落涂片，革蘭染色后，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。副豬嗜血桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，菌體大小不一。該櫟諼碼戇沖巋鳧薩錠謨贛贅眾騶嶠。 衛(wèi)星實驗用接種環(huán)分別挑取上述可疑菌的單菌落，水平劃線于綿羊鮮血瓊脂平板上， 再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，３７℃ 培養(yǎng) ２４ ｈ～４８ ｈ，觀察是否有“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象。劇妝諢貰攖蘋塒呂侖廟痙湯籪糶駒責。在純化培養(yǎng)后的TSA 培養(yǎng)基上挑取單菌落，接入加有1% NAD 與5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)18h左右。取培養(yǎng)后的菌液1μL做PCR鑒定，陽性對照為副豬嗜血桿菌參考株SH0165。陰性對照不加模板。根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA(M75065)序列設(shè)計引物。由金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成，見表51。采取20 μL反應(yīng)體系，組成成分見表52。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸1 min，30 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。臠龍訛驄椏業(yè)變墊羅蘄囂馱廣閏駙孫。表1 副豬嗜血桿菌PCR鑒定引物序列引物PCR引物序列目標條帶上游引物5’GGCTTCGTCACCCTCTGT3’822 bp下游引物5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’表2 PCR體系各組分一覽表組成成分用量(μL)2EasyTaq Super Mix10上游引物1下游引物1菌液1滅菌雙蒸水7 1%瓊脂糖凝膠電泳稱取1g瓊脂糖，加入100mL 1TAE 緩沖液中，加入核酸染料，依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子，瓊脂糖溶化后混勻倒入在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。鰻順褸悅漚縫囅屜鴨騫鬩藶騍擯駟謔。取10181。LPCR擴增產(chǎn)物和3181。L上樣緩沖液混勻后加入加樣孔，每次電泳時，各做一個陽性對照和陰性對照。電泳條件：電壓110V，電泳時間30min。穡釓虛綹滟鰻絲懷紓濼視嬌賭謗駔墮。結(jié)果判定：電泳結(jié)束后，取出膠塊置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進行成像分析。如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與副豬嗜血桿菌陽性對照的條帶在一條直線上，即條帶與加樣孔的距離相同，而陰性對照無此條帶，則該樣品分離到的菌株可初步判定為副豬嗜血桿菌。隸誆熒鑒獫綱鴣攣駘賽澇鈧籜軍驢該。 副豬嗜血桿菌的保存在純化后的平板上挑取單菌落與8mL肉湯中，置于37℃搖床中培養(yǎng)18~24h，待菌液生長至對數(shù)期，于9000r/min，離心3分鐘，棄去上清液，加入4mL滅菌的脫脂牛奶，重懸。再分裝值滅菌的凍干管，每管1mL。再將分裝的菌進行逐級冷凍，先后置于4℃，20℃，80℃至少4h以上。最后將菌液置于凍干機凍干1~2天，凍干后置于80℃冰箱長期保存。浹繢膩叢著駕驃構(gòu)碭湊農(nóng)瑤帳結(jié)駁噴。八、動物源偽結(jié)核棒狀桿菌的分離與鑒定方法1 范圍本標準規(guī)定了動物源偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定方法。本標準適用于膿汁中偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定2 設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 生物安全柜 冰箱：0 ℃ ~ 4 ℃ 和 20 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ 177。 1 ℃ 顯微鏡：10 ~ 100 EP管: ml 采樣管 采樣棉拭子 微量加樣器 吸頭 （與微量加樣器相匹配） PCR儀 微波爐 電泳儀 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）3 培養(yǎng)基和試劑 DNA Marker 引物及擴增片段長度PLD基因引物：上游：CTCAAGGCGTGGATGA下游：GGTAGCCAGATGGTGAGTAG 運送培養(yǎng)基 10 ％的綿羊脫纖血平板 2Taq PCR MasterMix （含染料） 瓊脂糖 50TAE緩沖液：將242 g Tris 堿， ml 冰乙酸，100 ml EDTA（pH ），加純水至1000 ml。鈀燭罰櫝箋礱颼畢韞糲銨鵬駱隸驅(qū)訛。1TAE緩沖液：臨用時將50TAE緩沖液1份加蒸餾水49份，混勻即可。 溴化乙錠溶液（10㎎/ml）：稱取1 g溴化乙錠溶于100 ml水中，用磁力攪拌器攪拌數(shù)小時至完全溶解，避光冷藏（4 ℃）保存。愜執(zhí)緝蘿紳頎陽灣熗鍵艤訥贓棧馴嘆。4 偽結(jié)核棒狀桿菌分離與鑒定程序動物膿汁樣品運送培養(yǎng)基接種于10 ％的綿羊脫纖血平板挑取偽結(jié)核棒狀桿菌可疑菌落純化生化鑒定PCR鑒定偽結(jié)核棒狀桿菌貞廈給鏌綞牽鎮(zhèn)獵鎦龐朮戧籩賂馱見。圖8 偽結(jié)核板狀桿菌分離鑒定程序5 操作步驟 采樣無菌采取膿汁樣品置于運送培養(yǎng)基中，0 ℃—4 ℃保存。 分離將新鮮的或運送培養(yǎng)基中的膿汁拭子在10％綿羊脫纖血瓊脂平板上涂抹，用經(jīng)火焰滅菌后冷卻的接種環(huán)劃線。 培養(yǎng)將上述接種后的平板置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h~48h。 純化觀察24h和48h的血瓊脂平板上的菌落形態(tài)，挑取圓形、不透明、干燥、松脆、瓷白色或淡黃色、。（革蘭氏染色呈陽性小球桿菌）嚌鯖級廚脹鑲銦礦毀蘄鷯鑭嶁盧馭勞。 生化鑒定對于已純化的菌落，可使用細菌微量生化反應(yīng)管進行生化鑒定，并對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行結(jié)果判定。 PCR鑒定 PCR模板的制備 ml生理鹽水的小型離心管中，12000r/min離心兩分鐘，棄上清。，100℃水浴10min，12000r/min離心兩分鐘，取上清作為PCR模板。薊鑌豎牘熒浹醬籬鈴騫違紗駑緩馬蝕。 PCR反應(yīng)體系根據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配置PCR反應(yīng)體系。擴增目的片段長度約758 bp. PCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性2min，94 ℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30個循環(huán)，最后72℃終延伸10min，同時設(shè)立陰性和陽性對照。齡踐硯語蝸鑄轉(zhuǎn)絹攤濼絡(luò)減貽顏饌農(nóng)。 電泳，加入100ml 1TAE緩沖液。加熱熔化后倒入水平臺面的凝膠盤中，膠板厚約5 mm。依據(jù)樣品數(shù)選擇適宜的梳子。凝膠凝固后，放入電泳槽，于加樣孔中加樣，以 DL2000為對照，120v，30min 后，在溴化乙錠溶液中浸泡20min。之后于紫外凝膠成像系統(tǒng)或紫外投射儀中觀察結(jié)果。紳藪瘡顴訝標販繯轅賽憮賄豎毆饉蒞。 結(jié)果判定如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與偽結(jié)核棒狀桿菌陽性對照的條帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，則該樣品可判定為偽結(jié)核棒狀桿菌。必要時可通過16S rRNA測序進行進一步驗證。飪籮獰屬諾釙誣苧徑凜騙橥峽軋饈俠。附件5 藥敏試驗檢測試劑盒（MIC測定）使用方法范圍本方法規(guī)定了動物源細菌（大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、魏氏梭菌和偽結(jié)核棒狀桿菌）藥敏檢測試劑盒的操作方法。烴斃潛籬賢擔視蠶賁粵貫飭驢噦餾艱。材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱35177。2℃ 生物安全柜 濁度計或者標準比濁管 微量加樣器1uL~1000uL 吸頭（與微量加樣器匹配）操作步驟 取出試劑盒，打開包裝待用。 菌液制備將無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，直接取過夜培養(yǎng)皿上數(shù)個新鮮菌落，與適量無菌生理鹽水混勻。然后，（1~2108CFU/mL）。最后，用試劑盒中的肉湯按照使用說明書要求的倍數(shù)稀釋，混勻備用。鋝豈濤軌躍輪蒔講嫗鍵礪脈賁膚饃麗。 菌液接種除空白對照外，其余的95孔加入制備好（用前要混勻）的菌液100181。L空白對照孔中加入100181。L無菌肉湯。蓋好板蓋并記錄菌號。 孵育將檢測板置于35℃177。2℃很穩(wěn)培養(yǎng)箱中孵育16~18小時。 觀察結(jié)果在襯有黑底板的光線下，用肉眼觀察。先觀察陰性對照孔和陽性對照孔：陰性對照孔應(yīng)無細菌生長，孔內(nèi)液體未見渾濁；陽性對照孔內(nèi)應(yīng)有細菌生長所形成的圓形或者網(wǎng)狀沉淀。擷偽氫鱧轍冪聹諛詼龐復堝窮馭餿職。如果陰性和陽性對照結(jié)果正常，繼續(xù)觀察其余孔內(nèi)細菌生長情況，在無細菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。蹤飯夢摻釣貞綾賁發(fā)蘄韃釓嶇淶饋麩。結(jié)果記錄將MIC結(jié)果記錄在耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計表（附件6）中。附件6敏感性檢測結(jié)果統(tǒng)計表一、G菌（大腸桿菌、沙門氏菌和副豬嗜血桿菌）MIC 養(yǎng)殖場： 檢測員： 年 月 日婭鑠機職銦夾簣軒蝕騫設(shè)猶饌還館縉。菌株編號氨芐西林阿莫西林/克拉維酸頭孢他啶頭孢噻呋慶大霉素大觀霉素四環(huán)素氟苯尼考磺胺異噁唑復方新諾明恩諾沙星氧氟沙星美羅培南乙酰甲喹安普霉素黏菌素AMA/CCTDCFTGMSPTTEFFCSFSXTENROFXIPMMEQAPCOL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。二、G+菌（腸球菌、金黃色葡萄球菌和偽結(jié)核棒狀桿菌）MIC 養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號青霉素阿莫西林/克拉維酸頭孢噻呋頭孢西丁苯唑西林慶大霉素多西環(huán)素恩諾沙星氧氟沙星磺胺異噁唑復方新諾明氟苯尼考紅霉素克林霉素替米考星泰妙菌素利奈唑胺萬古霉素PA/CCFTCXOXAGENDOXENROFLSFSXTFFCERYCLITILTMLNZVA注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。三、彎曲桿菌MIC養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號慶大霉素四環(huán)素萘啶酸環(huán)丙沙星氟苯尼考紅霉素克林霉素阿奇霉素泰利霉素GENTETNALCIPFFCERYCLIAZITEL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。四、腸球菌和魏氏梭菌MIC（促生長抗菌藥物監(jiān)測）養(yǎng)殖場： 檢測員：年 月 日 菌株編號阿維拉霉素維吉尼亞霉素四環(huán)素吉他霉素桿菌肽那西肽黃霉素恩拉霉素喹烯酮氟苯尼考沃尼妙林AVLVGATETFFNBCTNOSFLVERAQCTFFCVOL注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。