重組子的篩選與鑒定(編輯修改稿)
2025-06-10 05:18 本頁面
【文章內容簡介】 一面朝上放置在預先被強堿溶液浸濕的普通濾紙上進行溶菌和堿變性處理。強堿可以裂解細菌 ， 釋放細胞內含物 ， 降解 RNA， 并使蛋白和 DNA變性。 ③將濾膜轉移至預先被中性緩沖液浸濕的普通濾紙上 ， 中和 NaOH 。 ④將濾膜轉移到清洗緩沖液中短暫浸泡 ， 洗去菌體碎片和蛋白質。 ⑤取出濾膜晾干 ， 置于 80℃ 下干燥 ， 使單鏈 DNA牢固地結合在硝酸纖維素濾膜上。 ⑥將濾膜轉入探針溶液中 ， 進行雜交反應。 ⑦雜交反應結束后 ， 清洗濾膜 ， 除去未特異性雜交的探針 ， 然后晾干。 ⑧ 將濾膜與 X線片壓緊置于暗箱內曝光 ， 由膠片上感光斑點的位置 ， 在原始平板上挑出相應的陽性重組子菌落 特點：對應的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。 斑點印跡雜交 如果只要檢測克隆菌株、動植物細胞株或轉基因個體、器官、組織提取的總 DNA或RNA樣品中是否含有目的基因 ， 則可采用斑點印跡雜交 (dot blotting)或狹線印跡雜交 (slot blotting)進行檢測 ， 它們是在 Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的兩種相似的快速檢測特異核酸 (DNA或 RNA)分子的核酸雜交技術。 斑點雜交法與菌落原位雜交的原理一樣，但方法更簡單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉化子提取的 DNA(RNA)樣品直接點在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，與探針進行分子雜交。通過放射自顯影，從底片中找出黑點即為陽性斑點。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。 Northern blotting Northern 印跡雜交是指將 RNA分子變性及電泳分離后 ，從電泳凝膠轉移到固相支持物上進行核酸雜交的方法 ，又稱為 Northern RNA印跡雜交等。 該法是在 Southern blotting雜交基礎上發(fā)展起來的 ， 主要針對 RNA分子的檢測 ， 基本步驟與 Southern印跡雜交相似。但 RNA分子與 DNA分子有所不同 ， 一般不能采用堿變性處理 ， 同時 ， 在 RNA電泳時必須解決兩個問題 ：一是防止單鏈 RNA形成高級結構 ， 故必須采用變性凝膠電泳 ； 二是電泳過程中始終要有效抑制 RNase的作用 ，防止 RNA分子的降解破壞。 用 DNA（或 RNA）探針檢測 RNA樣品。 主要檢測插入片斷是否被轉錄。 從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。 第三節(jié) 電泳檢測法 1直接凝膠電泳檢測法 2 切酶酶切片段電泳分析法 3 PCR擴增檢測法 利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。 直接電泳檢測法 從轉化后的菌體克隆中分離質粒，電泳、比較其分子量。出現(xiàn)滯后，稱滯后現(xiàn)象 分子量 Marker 載體 重組克隆 2 限制性核改內切酶酶切片段電泳分析法 原理： 根據(jù)已知的外源 DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內切酶切割質粒，電泳后比較電泳結果（ DNA帶數(shù)和長度）。 或用合適的內切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結果是否符合預計的結果。 A B A或 B 不同克隆的酶切結果 篩選過程 表型篩選加酶切篩選AATTAATT PCR擴增檢測法 原理 PCR能在模板序列上擴增出預期 DNA片斷。 過程 （ 1）從重組克隆中提取質粒（或 DNA）。 （ 2）用外源 DNA插入片斷引物作 PCR。 （ 3）電泳 PCR產(chǎn)物。 （ 4）檢查是否有 PCR產(chǎn)物。 （ 5） PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。 第四節(jié) 免疫化學檢測法 免疫化學檢測法是一種間接的篩選方法，它利用特異性抗體與外源 DNA編碼的抗原的相互作用進行篩選，特別適用于檢測不為宿主提供任何檢測標志的基因。 使用該方法的前提是 插入的外源基因必須在受體細胞中表達，必須具有目的蛋白質的抗體 。 常見的有 放射性抗體檢測法、免疫沉淀檢測法、wetem印跡分析法 等 第四節(jié) 免疫化學檢測法 1 放射性抗體檢測法 2 免疫沉淀檢測法 3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ ELISA） 4 western印跡分析法 利用 抗體 作為 “ 探針 ” 來檢測轉入受體
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