i基因文庫與篩選ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-25 22:05 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 長到一定濃度后，加入終濃度為 25% 的甘油，于 70 oC或 25 oC下保存。 缺點：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 通常不用原核 mRNA來構(gòu)建 cDNA文庫，因為原核 mRNA通常不穩(wěn)定；相比之下則較易制備基因組文庫，且可包含所有基因組序列。 ?從真核 mRNA構(gòu)建 cDNA是非常有用的，因為 cDNA不含內(nèi)含子序列，可被用來在大腸桿菌中表達編碼蛋白。 真核生物基因組 DNA十分龐大，其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和mRNA的 100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。 采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體 DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個主要困難。 高等生物一般具有 105種左右不同的基因，但在一定時間階段的單個細胞或個體中，都只有 15%左右的基因得以表達，產(chǎn)生約 15000種不同的 mRNA分子。由 mRNA出發(fā)的 cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。 cDNA文庫 南京林業(yè)大學 cDNA基因文庫構(gòu)建的步驟 ? 細胞總 RNA的提取和 mRNA的分離 ? 第一條 cDNA合成 ? 第二條 cDNA合成 ? 雙鏈 cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖 南京林業(yè)大學 cDNA文庫的構(gòu)建： 基因重組 反轉(zhuǎn)錄酶 mRNA cDNA 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 mRNA完整性的檢測 1)mRNA分子的大?。? 哺乳動物 mRNA長度為5008000bp，大部分 mRNA位于 . 2)總 mRNA指導合成 cDNA第一鏈長分子的能力 南京林業(yè)大學 mRNA在細胞中的豐度 1) 高豐度 mRNA 目的 mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總 mRNA量的 5090%, 該類mRNA在合成和克隆 cDNA之前不需進一步純化特定 mRNA 。 2) 低豐度 mRNA 目的 mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總 mRNA量的 %以下。 mRNANA RNA 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 南京林業(yè)大學 第一鏈 cDNA的合成 ? oligo(dT)引導的 DNA合成法： 利用真核 mRNA分子所具有的 poly(A)尾巴的特性，加入 1220個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的 oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA的第一鏈。 南京林業(yè)大學 ? 引導合成法：獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列 第二鏈 cDNA的合成 末端轉(zhuǎn)移酶 DNA聚合酶 I缺失 5‘至 3’外切酶活性的截短部分 南京林業(yè)大學 雙鏈 cDNA末端的形成及其接頭添加 南京林業(yè)大學 基因組 DNA文庫 cDNA文庫 附：基因組 DNA文庫與 cDNA文庫的比較 南京林業(yè)大學 1
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