i基因文庫(kù)與篩選ppt課件(已修改)
2025-05-10 22:05 本頁(yè)面
【正文】 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) ? 對(duì)于高等真核生物而言，基因組 DNA十分龐大 ,基因可達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。 南京林業(yè)大學(xué) ? 為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無(wú)法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫(kù)，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來(lái)，最后分離得到目的基因。 南京林業(yè)大學(xué) 目的基因： 已知基因： 未知基因：構(gòu)建基因文庫(kù) 特定探針的制備 文庫(kù)的篩選（篩庫(kù)） 含目的基因的克隆 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) ?基因文庫(kù)的好壞要看該文庫(kù)是否覆蓋起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作喪失其中的基因或某些序列。 ?構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，一個(gè)最重要的指標(biāo)就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆蓋所有原初序列 (代表性文庫(kù) )?如果某些序列如缺少限制性酶切位點(diǎn)的重復(fù)序列未被克隆，這樣的文庫(kù)就不具代表。 ?同樣如果文庫(kù)中未能含有足量的克隆，則極有可能會(huì)丟失某些基因。富含某種序列的 cDNA文庫(kù)顯然會(huì)缺少其他一些基因，但若正確制備并擴(kuò)增，也可以成為富含 mRNA起始材料的具代表性的文庫(kù)。 具有代表性的基因組文庫(kù) 南京林業(yè)大學(xué) 只有當(dāng)此文庫(kù)中重組子總數(shù)達(dá)到某一值時(shí)，才能包含基因組中所有基因，才可稱之為完整基因組文庫(kù)。所需重組子數(shù)目主要取決于基因組的大小和目的基因片段的大小。 1975 年，Clarke 和 Carbon 提出了一個(gè)計(jì)算這一重組子數(shù)目的公式。 南京林業(yè)大學(xué) N=ln(1P)/ln(1f) N 為所需的重組子的數(shù)目； f 為單個(gè)重組體中插入片段平均大小與基因組DNA 總量之比； P 為選出某一基因的概率 (通常期望為 99%)。 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) 南京林業(yè)大學(xué) I14載體 對(duì)于某一特定的基因組，構(gòu)成其 DNA 文庫(kù)所需的重組子的數(shù)目，在很大程度上與構(gòu)建文庫(kù)所用的載體的容量緊密相關(guān)。 ? 質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、 BAC或酵母人工染色體等載體都可被用來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù)，選用哪種載體取決于基因組的大小。這些載體所能插入的片段大小的上限分別依次為 10kb、23kb、 45kb、 350kb和 1000kb用 T4DNA連接酶將基因組 DNA片段與制備好的載體分子相連接。
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