重組子的篩選與鑒定(完整版)
【正文】 Z’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。 （ 1）四環(huán)素抗性插入失活 如果在 Tetr上插入外源 DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用 四環(huán)素加環(huán)絲氨酸 平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。因此， 包裝限制 這一特性，保證了體外重組所形成的有活性的 λ重組體分子，一般都應(yīng)帶有外源 DNA的插入片段， λ噬菌斑的形成本身就是對 λ重組體的一種篩選特征。這就需要設(shè)計(jì)出容易于篩選重組子克隆的方案并加以驗(yàn)證，這就是我們這一章要討論的內(nèi)容。 轉(zhuǎn)化子 就是導(dǎo)入外源 DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。 對 λ噬菌體的置換型載體來說。 殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌?？梢员?IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 第二節(jié) 核酸分子雜交檢測法 1 原理 2 核酸雜交檢測方法 利用堿基配對的原理進(jìn)行分子雜交是核酸分析的重要手段，也是鑒定基因重組體的常用方法。它是根據(jù)毛細(xì)管作用的原理 ， 使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上 ， 然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移的 DNA片段。 ④ 漂洗去除游離的沒有雜交上的探針分子 ， 經(jīng)放射自顯影后 ， 便可鑒定出與探針的核昔酸序列同源的待測 DNA片段。 ④將濾膜轉(zhuǎn)移到清洗緩沖液中短暫浸泡 ， 洗去菌體碎片和蛋白質(zhì)。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。 直接電泳檢測法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。 （ 5） PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。取出含有抗原 抗體復(fù)合物的聚乙烯薄膜，放入預(yù)先用同位素 125 I標(biāo)記的抗體溶液中溫浴，薄膜上的抗原就會與 125I標(biāo)記的抗體相結(jié)合。 . 方法 免疫沉淀檢測法 對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。 二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。 電泳 buffer 電泳 buffer 點(diǎn)樣 電泳方向 ③ 蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn) 已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。 待測蛋白 硝酸纖 維素膜 一抗 二抗 辣根過氧 化物酶 底物 產(chǎn)物， 并發(fā)出光 PAGE膠 待測蛋白 底片曝光 辣根過氧化物酶： HRPO 1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。 核苷酸序列分析的方法，主要有 MaxamGilbert化學(xué)降解法和 Sanger雙脫氧鏈終止法 (酶法 )。消化物與酵母 DNA連接后轉(zhuǎn)化對兩種抗生素都敏感的 Ecoli菌株．試問： (1)利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)杜的細(xì)胞 ? (2)怎樣區(qū)分接受了插入酵母 DNA的質(zhì)杜的克隆 ? 3 斑點(diǎn)印跡雜交與 Southern印跡雜交相比，主要有哪些差別 ? 4說明 Southern印跡雜交的原理和方法。 2 PCR法 PCR技術(shù)以載體或目的基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物進(jìn)行檢測，具體方法已經(jīng)在前面講過，在此不再敘述。 3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有 HRPO）。 一克約為 6 1023道爾頓 Dalton SDS PAGE ④ 凝膠中的蛋白質(zhì)染色： 考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出 ，但可褪色回收。 （ 4）顯色反應(yīng) 在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。 二抗（ secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。 既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。 使用該方法的前提是 插入的外源基因必須在受體細(xì)胞中表達(dá)，必須具有目的蛋白質(zhì)的抗體 。 或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。 該法是在 Southern blotting雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 ， 主要針對 RNA分子的檢測 ， 基本步驟與 Southern印跡雜交相似。 ⑥將濾膜轉(zhuǎn)入探針溶液中 ， 進(jìn)行雜交反應(yīng)。 酶切前 酶切后 插入片斷 載體 Southern blot 篩選結(jié)果 是直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 ，不必進(jìn)行核酸分離純化、內(nèi)切酶酶解及電泳分離等操作 ，而是經(jīng)溶菌和變性
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