重組子的篩選與鑒定-資料下載頁
2025-05-14 05:18本頁面
【正文】 與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 ① SDS: （ SDSPAGE）： 4 免疫印跡（ western blotting）法 ② 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）： （ Polyacrylamide gel electrophoresis） 在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。 電泳 buffer 電泳 buffer 點(diǎn)樣 電泳方向 ③ 蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn) 已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。 商品化供應(yīng) Da 道爾頓 (質(zhì)量單位 , 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。 一克約為 6 1023道爾頓 Dalton SDS PAGE ④ 凝膠中的蛋白質(zhì)染色： 考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出 ，但可褪色回收。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出 25ng/帶。 2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。 1）直接染色 直接染色電泳結(jié)果 （ 2） Western blotting 電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、 PVDF膜、中性尼龍膜等）。 ① Western（轉(zhuǎn)膜） 膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。 膜 膠 蛋白 Western裝置 ② Blotting 原理與 ELISA相同。 待測蛋白 硝酸纖 維素膜 一抗 二抗 辣根過氧 化物酶 底物 產(chǎn)物， 并發(fā)出光 PAGE膠 待測蛋白 底片曝光 辣根過氧化物酶： HRPO 1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。 2）洗去未結(jié)合的一抗。 3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有 HRPO）。 4）清洗掉未結(jié)合的二抗。 5）用 HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，沖洗膠片。 ③ Blotting過程 Immuno Blotting ④結(jié)果 多克隆抗體Blotting的結(jié)果 單抗 blotting結(jié)果 第五節(jié) 核酸序列分析及其他方法 1 核酸序列分析 2 PCR法 3 Nonthern印跡分析 … 1 序列分析 核酸序列分析是指通過一定的方法確定 DNA分子上的核苷酸排列順序，也就是測定 DNA分子的 A、 T、 G、 C的排列順序。測序的結(jié)果直接反映了轉(zhuǎn)化子中有無目的基因的存在。 核苷酸序列分析的方法，主要有 MaxamGilbert化學(xué)降解法和 Sanger雙脫氧鏈終止法 (酶法 )。這兩種方法對 DNA測序的原理不相同，但都建立在高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)之上，將差別僅有一個(gè)核苷酸的單鏈DNA區(qū)分開來，其長度可達(dá) 300500bp. 隨著 DNA測序技術(shù)的不斷發(fā)展和其重要性的日益提高，DNA序列分析已變得越來越簡單快速，朝著自動化和商品化的方向發(fā)展，從而極大地提高了 DNA序列分析的速度及準(zhǔn)確性。 2 PCR法 PCR技術(shù)以載體或目的基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物進(jìn)行檢測，具體方法已經(jīng)在前面講過，在此不再敘述。 3 Northern印跡分析 Northern印跡雜交是檢測特定基因是否轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)弱情況。它不但用于基因工程中檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄情況，而且已廣泛用于功能基因調(diào)控的研究。具體方法是從細(xì)胞中提取 mRNA，經(jīng)電泳將不同大小的 mRNA分子分開后，印跡轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，與特定的探針 DNA雜交后，洗去未雜交上的標(biāo)記探針 DNA。經(jīng)放射自顯影顯帶，根據(jù)帶密度的強(qiáng)弱就可確定其表達(dá)的相對值。 1 什么是重組子篩選 ?主要有那些方法 ? 2 一個(gè)攜帶有氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霧素基因中有識別位點(diǎn)的及” RI消化。消化物與酵母 DNA連接后轉(zhuǎn)化對兩種抗生素都敏感的 Ecoli菌株．試問： (1)利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)杜的細(xì)胞 ? (2)怎樣區(qū)分接受了插入酵母 DNA的質(zhì)杜的克隆 ? 3 斑點(diǎn)印跡雜交與 Southern印跡雜交相比，主要有哪些差別 ? 4說明 Southern印跡雜交的原理和方法。
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