重組子的篩選與鑒定(存儲(chǔ)版)
【正文】 A， 并使蛋白和 DNA變性。 斑點(diǎn)雜交法與菌落原位雜交的原理一樣，但方法更簡單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉(zhuǎn)化子提取的 DNA(RNA)樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，與探針進(jìn)行分子雜交。 從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。 （ 3）電泳 PCR產(chǎn)物。把原平板放置在氯仿蒸汽中，使細(xì)菌菌落裂解，釋放出抗原。 . 原理 抗原 —— 抗體凝集反應(yīng)。 （ 2）一抗結(jié)合 一抗 加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。 （ 1） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 ① Western（轉(zhuǎn)膜） 膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。 ③ Blotting過程 Immuno Blotting ④結(jié)果 多克隆抗體Blotting的結(jié)果 單抗 blotting結(jié)果 第五節(jié) 核酸序列分析及其他方法 1 核酸序列分析 2 PCR法 3 Nonthern印跡分析 … 1 序列分析 核酸序列分析是指通過一定的方法確定 DNA分子上的核苷酸排列順序，也就是測定 DNA分子的 A、 T、 G、 C的排列順序。經(jīng)放射自顯影顯帶，根據(jù)帶密度的強(qiáng)弱就可確定其表達(dá)的相對(duì)值。它不但用于基因工程中檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄情況，而且已廣泛用于功能基因調(diào)控的研究。 5）用 HRPO的底物浸泡膜。 2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。 必須與其他方法一起綜合考慮。 3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ ELISA） 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 酶 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 無色的底物 有色的產(chǎn)物 比色觀察 酶 19 . ELISA檢測的一般步驟 （ 1）固定樣品 將待測樣品加入 96孔微量滴定板（ microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。在溶菌酶的作用下，菌落表面的細(xì)菌發(fā)生溶菌反應(yīng)，逐步釋放出細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)。 根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式： 1. 1 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式 對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測 。 過程 （ 1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或 DNA）。 用 DNA（或 RNA）探針檢測 RNA樣品。 ⑧ 將濾膜與 X線片壓緊置于暗箱內(nèi)曝光 ， 由膠片上感光斑點(diǎn)的位置 ， 在原始平板上挑出相應(yīng)的陽性重組子菌落 特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。以菌落原位雜交為例 ， 操作步驟如下 : ①將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面 ， 使其中的質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上。 由于干燥濾紙或吸水紙的虹吸作用 ， 凝膠中的單鏈 DNA便隨著電泳緩沖液一起轉(zhuǎn)移 ， 一旦同硝酸纖維素濾膜接觸 ， 就會(huì)牢固地結(jié)合在它的上面 ，這樣在凝膠中的 DNA片段就會(huì)按原譜帶模式吸印到濾膜上。 核酸 雜交 原理： 重組克隆與探針雜交。不能互補(bǔ)。 Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。 在 PBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生隸抗性基因， Tetr上有插入位點(diǎn)BamH I和 Sal I。 陽性克隆的篩選與鑒定可以從不同的層次、利用不同的方法進(jìn)行。得到所需要的帶有重組DNA的轉(zhuǎn)化子是基因工程的目的所在。 含有一個(gè)選擇標(biāo)記 :實(shí)際操作中，最典型的方法是使用抗藥性標(biāo)記的插入失活作用，或是 β— 半乳糖苷酶基因的顯色反應(yīng)，將重組體 DNA分子的轉(zhuǎn)化子同非重組的載體轉(zhuǎn)化子區(qū)別開來。 抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。 受體菌基因組 中有突變的 ?半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。 例如．當(dāng)外源目的基因?yàn)楹铣闪涟彼岬幕驎r(shí)，將該基因重組后轉(zhuǎn)入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在僅僅缺少亮氨酸的基本培養(yǎng)基上篩選，只有能利用表達(dá)產(chǎn)物亮氨酸合成酶的菌株存活。 （ 2）非放射性標(biāo)記 熒光素 根據(jù)待測核酸的來源以及將其分子結(jié)合到固體支持物上的不同，核酸雜交主要有 菌落印跡原位雜交 斑點(diǎn) (dot)印跡雜交 Southern
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