【文章內容簡介】 于細胞漿內。 方法： HL60 細胞株是篩選分化誘導劑的 ,藥物作用后 , 細胞形態(tài)向粒細胞方向分化。 結果： 顯微鏡計數 NBT還原陽性細胞，計算誘導分化率 對照組 藥物處理組 ３ . 誘導腫瘤細胞凋亡實驗 Ａ）形態(tài)學觀察（透射電鏡） 原理： 細胞超微結構觀察 方法： 藥物處理后，收集細胞， 4%戊二醛固定 2 h以上， PBS清洗， 1%俄酸固定 1 h,酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片做成銅網，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。 對照組 凋亡細胞 正常細胞胞質散在內質網、核膜清楚、染色質均勻、核仁明顯。 凋亡細胞染色質濃縮、致密，沿核分布形成新月體狀，有凋亡小體出現。 對照組 壞死 線粒體腫脹 凋亡細胞胞質出現明顯的線粒體腫脹。 壞死細胞細胞膜不完整，核膜破裂，染色質呈蟲蝕狀溶解。 B） DNA形態(tài)觀察（ Hoeschst333258） 原理 ： Hoeschst333258與 DNA特異性結合發(fā)出藍色熒光 方法： 腫瘤細胞用 Hoeschst333258染色后，在熒光顯微鏡下觀察 結果： 活細胞成均勻的淡熒光，調亡細胞核或細胞質內可見強熒光的顆粒狀物質。 對照組 藥物處理組 C）染色體ＤＮＡ斷裂測定 原理： 凋亡細胞內源性核酸酶激活，ＤＮＡ鏈被切割成 200 bp不同倍數的片段，將這些片斷進行電泳，可觀察到ＤＮＡ梯帶 方法： 裂解腫瘤細胞，消化蛋白，提?。模危?，上凝膠電泳，ＥＢ染色后，ＵＶ燈下觀察。 結果： 凋亡細胞顯示ＤＮＡ梯帶。 CTL DRUG1 DRUG2 MARKER ３） PI/AnnexinＶ FITC雙染色分析 原理： 調亡細胞磷脂酰絲氨酸（ PS）暴露于細胞 表面， PS結合標記熒光素 FITC的 AnnexinV 但細胞膜仍然完整，熒光染料ＰＩ不能進 入，而調亡晚期的細胞可同時受 AnnexinV 和 PI的雙標記。 方法： 腫瘤細胞同時加入 AnnexinＶ和ＰＩ染色， 用流式細胞儀分析。 正常細胞 AnnexinV () PI () 晚期凋亡細胞 AnnexinV (+) PI (+) 早期凋亡細胞 AnnexinV (+) PI () AnnexinV PI PI/AnnexinVFITC 雙染激光共聚焦分析結果 PI紅色熒光細胞核 AnnexinVFITC 綠色熒光 細胞膜 AnnexinVFITC PI 對照組 藥物處理組 ４ . 抗腫瘤血管生成實驗 腫瘤發(fā)生、生長和轉移與 新生血管 形成密切相關，當腫瘤直徑超過 2 mm時 ,直接由微環(huán)境提供的營養(yǎng)就不能滿足其生長需要 ,此時 腫瘤的生長依賴于新生血管 運送營養(yǎng)物質。 腫瘤血管生成抑制劑能抑制血管生成 ,阻止腫瘤生長和轉移，在治療腫瘤中具有高效、廣普、副作用小、不易產生耐藥性等優(yōu)點。 １）血管內皮細胞體外篩選模型 原理： 體外培養(yǎng)的血管內皮細胞在含生長因子條件下 能形成細胞條索，然后形成管狀。腫瘤血管生 成抑制劑能抑制細胞管腔的形成。 方法： 人臍靜脈血管內皮細胞在含有藥物和不含有 TAI 藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)后 ,在顯微鏡下比較 它們形成的管腔數目。 對照組 藥物處理組 ２）雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型 原理： 雞卵在胚胎發(fā)育過程中，尿囊膜上的血管生長 很旺盛，將不同藥物作用于尿囊膜，觀察該膜 上的血管生長。 方法： 雞胚胎放在直培養(yǎng)皿內 , 在無菌恒溫箱中孵育 到第 9 天的生長高峰時 ,將浸泡過藥物 的明膠 海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面，培養(yǎng)２天，在 顯微鏡下隨機取幾個視野點 ,記數“熱點”區(qū)的新 生血管數 ,計算平均值。 血管生成 抑制率（ %） 對照組血管面積－給藥組血管面積 對照組血管面積 X100% ＝ 結果： CTL 低劑量藥物 高劑量藥物組 ３）斑馬魚血管新生模型 斑馬魚被廣泛地應用于藥物篩選方面的研究。主要用于篩選抗血管生成藥物。 其胚胎早期發(fā)育的過程中 ,血管生成的模式比較簡單 , 主要出現在頭部和軀干部體節(jié)間 ,體節(jié)間的血管最初由背部的動脈出芽形成于相鄰體節(jié)之間。 斑馬魚胚胎 方法： 在 96 孔板上用藥物處理胚胎 ,通過血管內源 性堿性磷酸酶染色來顯示血管 ,進而評價藥 物對血管生成的作用。 結果： ５耐藥性逆轉實驗 腫瘤細胞耐藥性，分先天性耐藥性和獲得性耐藥性，也可分為原藥耐藥性和多藥耐藥性。多藥耐藥性基因 mdr1編碼表達 P糖蛋白 （ Pgp）是產生耐藥性的主要機制。 Pgp將化療藥物泵出體外，降低藥物在細胞內的濃度。 １）腫瘤耐藥性體外模型的建立 逐步增加腫瘤細胞培養(yǎng)基中抗癌藥物的濃度（ Dox）誘導產生腫瘤耐藥株。用 MTT法檢測藥物對敏感株和耐藥株的細胞毒性，同時測定 mdr1基因和 Pgp表達水平 。 0204060801001200 50 100 150 200 250 300D o x c o n c e n t r a t i o n [ u M ]Cell survival (%)H e p G 2 ( V e p )R H e p G 2 ( V e p )耐藥株 敏感株 Pgp 敏感株 耐藥株 2) 逆轉腫瘤多藥耐藥性作用的藥物篩選 方法： 采用 MTT法測定加逆轉劑前后 DOX對耐藥株的細胞 毒性。計算逆轉效果 . FR (逆轉倍數 )= IC50(不加逆轉劑 ) / IC50(加逆轉劑） IC50 (耐藥性肝癌細胞株RHepG2) FR Dox 160 uM Dox +Vep 31 uM 5 Effect of NSC23925 to reverse drug resisitance in MDR cell lines 用熒光酶標儀、熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測加藥前后耐藥細胞株內抗癌藥多柔比星 Dox的含量。 Control