【文章內(nèi)容簡介】 于細(xì)胞漿內(nèi)。 方法： HL60 細(xì)胞株是篩選分化誘導(dǎo)劑的 ,藥物作用后 , 細(xì)胞形態(tài)向粒細(xì)胞方向分化。 結(jié)果： 顯微鏡計(jì)數(shù) NBT還原陽性細(xì)胞，計(jì)算誘導(dǎo)分化率 對照組 藥物處理組 ３ . 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) Ａ）形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡） 原理： 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 方法： 藥物處理后，收集細(xì)胞， 4%戊二醛固定 2 h以上， PBS清洗， 1%俄酸固定 1 h,酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片做成銅網(wǎng)，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。 對照組 凋亡細(xì)胞 正常細(xì)胞胞質(zhì)散在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜清楚、染色質(zhì)均勻、核仁明顯。 凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、致密，沿核分布形成新月體狀，有凋亡小體出現(xiàn)。 對照組 壞死 線粒體腫脹 凋亡細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹。 壞死細(xì)胞細(xì)胞膜不完整，核膜破裂，染色質(zhì)呈蟲蝕狀溶解。 B） DNA形態(tài)觀察（ Hoeschst333258） 原理 ： Hoeschst333258與 DNA特異性結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光 方法： 腫瘤細(xì)胞用 Hoeschst333258染色后，在熒光顯微鏡下觀察 結(jié)果： 活細(xì)胞成均勻的淡熒光，調(diào)亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見強(qiáng)熒光的顆粒狀物質(zhì)。 對照組 藥物處理組 C）染色體ＤＮＡ斷裂測定 原理： 凋亡細(xì)胞內(nèi)源性核酸酶激活，ＤＮＡ鏈被切割成 200 bp不同倍數(shù)的片段，將這些片斷進(jìn)行電泳，可觀察到ＤＮＡ梯帶 方法： 裂解腫瘤細(xì)胞，消化蛋白，提?。模危粒夏z電泳，ＥＢ染色后，ＵＶ燈下觀察。 結(jié)果： 凋亡細(xì)胞顯示ＤＮＡ梯帶。 CTL DRUG1 DRUG2 MARKER ３） PI/AnnexinＶ FITC雙染色分析 原理： 調(diào)亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸（ PS）暴露于細(xì)胞 表面， PS結(jié)合標(biāo)記熒光素 FITC的 AnnexinV 但細(xì)胞膜仍然完整，熒光染料ＰＩ不能進(jìn) 入，而調(diào)亡晚期的細(xì)胞可同時(shí)受 AnnexinV 和 PI的雙標(biāo)記。 方法： 腫瘤細(xì)胞同時(shí)加入 AnnexinＶ和ＰＩ染色， 用流式細(xì)胞儀分析。 正常細(xì)胞 AnnexinV () PI () 晚期凋亡細(xì)胞 AnnexinV (+) PI (+) 早期凋亡細(xì)胞 AnnexinV (+) PI () AnnexinV PI PI/AnnexinVFITC 雙染激光共聚焦分析結(jié)果 PI紅色熒光細(xì)胞核 AnnexinVFITC 綠色熒光 細(xì)胞膜 AnnexinVFITC PI 對照組 藥物處理組 ４ . 抗腫瘤血管生成實(shí)驗(yàn) 腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移與 新生血管 形成密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤直徑超過 2 mm時(shí) ,直接由微環(huán)境提供的營養(yǎng)就不能滿足其生長需要 ,此時(shí) 腫瘤的生長依賴于新生血管 運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)。 腫瘤血管生成抑制劑能抑制血管生成 ,阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，在治療腫瘤中具有高效、廣普、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。 １）血管內(nèi)皮細(xì)胞體外篩選模型 原理： 體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在含生長因子條件下 能形成細(xì)胞條索，然后形成管狀。腫瘤血管生 成抑制劑能抑制細(xì)胞管腔的形成。 方法： 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在含有藥物和不含有 TAI 藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)后 ,在顯微鏡下比較 它們形成的管腔數(shù)目。 對照組 藥物處理組 ２）雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型 原理： 雞卵在胚胎發(fā)育過程中，尿囊膜上的血管生長 很旺盛，將不同藥物作用于尿囊膜，觀察該膜 上的血管生長。 方法： 雞胚胎放在直培養(yǎng)皿內(nèi) , 在無菌恒溫箱中孵育 到第 9 天的生長高峰時(shí) ,將浸泡過藥物 的明膠 海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面，培養(yǎng)２天，在 顯微鏡下隨機(jī)取幾個(gè)視野點(diǎn) ,記數(shù)“熱點(diǎn)”區(qū)的新 生血管數(shù) ,計(jì)算平均值。 血管生成 抑制率（ %） 對照組血管面積－給藥組血管面積 對照組血管面積 X100% ＝ 結(jié)果： CTL 低劑量藥物 高劑量藥物組 ３）斑馬魚血管新生模型 斑馬魚被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選方面的研究。主要用于篩選抗血管生成藥物。 其胚胎早期發(fā)育的過程中 ,血管生成的模式比較簡單 , 主要出現(xiàn)在頭部和軀干部體節(jié)間 ,體節(jié)間的血管最初由背部的動(dòng)脈出芽形成于相鄰體節(jié)之間。 斑馬魚胚胎 方法： 在 96 孔板上用藥物處理胚胎 ,通過血管內(nèi)源 性堿性磷酸酶染色來顯示血管 ,進(jìn)而評價(jià)藥 物對血管生成的作用。 結(jié)果： ５耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 腫瘤細(xì)胞耐藥性，分先天性耐藥性和獲得性耐藥性，也可分為原藥耐藥性和多藥耐藥性。多藥耐藥性基因 mdr1編碼表達(dá) P糖蛋白 （ Pgp）是產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。 Pgp將化療藥物泵出體外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度。 １）腫瘤耐藥性體外模型的建立 逐步增加腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中抗癌藥物的濃度（ Dox）誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤耐藥株。用 MTT法檢測藥物對敏感株和耐藥株的細(xì)胞毒性，同時(shí)測定 mdr1基因和 Pgp表達(dá)水平 。 0204060801001200 50 100 150 200 250 300D o x c o n c e n t r a t i o n [ u M ]Cell survival (%)H e p G 2 ( V e p )R H e p G 2 ( V e p )耐藥株 敏感株 Pgp 敏感株 耐藥株 2) 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用的藥物篩選 方法： 采用 MTT法測定加逆轉(zhuǎn)劑前后 DOX對耐藥株的細(xì)胞 毒性。計(jì)算逆轉(zhuǎn)效果 . FR (逆轉(zhuǎn)倍數(shù) )= IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑 ) / IC50(加逆轉(zhuǎn)劑） IC50 (耐藥性肝癌細(xì)胞株RHepG2) FR Dox 160 uM Dox +Vep 31 uM 5 Effect of NSC23925 to reverse drug resisitance in MDR cell lines 用熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測加藥前后耐藥細(xì)胞株內(nèi)抗癌藥多柔比星 Dox的含量。 Control